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致病性測定依據Koch法則，將菌株Sr－1的菌核在PDA平板上28℃培養10d，待產菌核。分別用菌餅（直徑5mm）和菌核刺傷、自然無傷接種健康芝麻植株根部［3］，即取菌餅和菌核分別貼于根部人工十字劃傷處和自然無傷處，以接種PDA培養基為空白對照，并外加浸有無菌水的棉球保濕，置于自然環境下培養（25～30℃）。每處理3次重復，共接種15株。3d后觀察發病情況，并描述癥狀。將發病的植株帶回實驗室，剪取前沿病部組織，保濕培養，誘導菌核產生。然后將菌核用75％酒精處理10s，0．1％升汞消毒3min，無菌水沖洗3次后置于PDA平板上28℃培養，獲得再分離菌株，觀察再分離菌株的菌落與菌核形態，并與原接種菌株Sr－1在相同培養條件下進行比較。

病原菌鑒定

形態學鑒定將菌株Sr－1的菌核接種在PDA平板上，28℃培養3d，觀察菌落形態。繼續培養10d后，用數顯游標卡尺隨機測量100粒成熟菌核的直徑，并記錄菌核形成過程的形狀、大小、色澤等，光學顯微鏡下觀察菌絲形態。

分子鑒定DNA的提取按以下方法進行：將菌株Sr－1的菌核接種在PDA平板上，28℃下培養3d，用5mm的打孔器在菌落邊緣切取菌餅，移接至100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）中，28℃靜止培養5d。將菌絲體用滅菌漏斗（內墊3層滅菌擦鏡紙）過濾，去除液體培養基，并用滅菌水沖洗菌絲體2～3次。用SDS法提取菌株Sr－1的基因組DNA：挑取適量菌絲體于滅菌的研缽中，加入適量SDS裂解液［配方：200mmol／LTris－HCl（pH7．5）、25mmol／LEDTA（pH8．0）、250mmol／LNaCl、0．5％SDS］充分研磨（研磨過程盡量不起泡），轉移適量菌絲體研磨液于EP管中，65℃水浴50min，每隔10min上下顛倒數次；加入5mol／L的醋酸鉀，4℃、12000r／min離心10min，取上清；加入1／2上清體積的Tris飽和酚（北京索萊寶科技有限公司生產）振蕩后靜置30～60s，再加入1／2體積的氯仿振蕩，4℃、12000r／min離心10min，取上清，用等體積氯仿重復抽提2次；加入0．6倍體積異丙醇和0．1倍體積的醋酸鈉充分振蕩，放置冰箱－20℃沉淀30min之后，4℃、10000r／min離心10min，棄上清。用75％乙醇清洗沉淀2次，無水乙醇清洗1次，開口放置3～4h。晾干后加入50μL的雙蒸水溶解沉淀，置于－20℃冰箱備用。用真菌核糖體基因內轉錄間隔區（rDNA－ITS）通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）（由大連寶生物有限公司合成）對菌株Sr－1的基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系（總體積50μL）：ddH2O19μL、ITS1與ITS4各2μL，DNA模板（菌株Sr－1基因組DNA）2μL，2×PCRMasterMix［天根生化科技（北京）有限公司生產］25μL。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性40s；54℃退火40s；72℃延伸45s，32個循環，最后72℃延伸10min。取5μLPCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以200bpDNALadder（天津博美科生物技術有限公司生產）作為DNA分子量標準，5V／cm電泳后，用溴化乙錠染色20min，于凝膠成像系統（型號：GelDocXR，美國Bio－Rad公司生產）中觀察、記錄電泳結果。委托上海英駿生物技術有限公司對擴增的菌株Sr－1的rDNA－ITS片段進行純化和測序后，通過NCBI網站（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／）上的BLAST程序與相關真菌的rDNA－ITS序列進行同源性比較，并用軟件MEGA5．1Beta2構建基于rDNA－ITS序列的系統發育樹，對菌株Sr－1進行分子鑒定。

生物學特性測定

溫度對病原菌生長及菌核形成的影響將菌株Sr－1的菌核接在PDA平板上28℃培養3d后，用內徑5mm的打孔器從菌落邊緣切取菌餅，接于PDA培養基平板中央，將PDA平板分別放置于4℃、7℃、10℃、13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃的系列溫度梯度下培養，每處理設3個重復。3d后用十字交叉法測量菌落直徑，并計算3個重復的平均值，平均值減去5mm作為病原菌實際生長的菌落直徑。10d后記錄產生的菌核數量，并用數顯游標卡尺（GB／T14899－94，桂林廣陸數字測控股份有限公司生產）測量菌核直徑。

方法將菌株Sr－1接于pH為4．0、4．5、5．0、5．5、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0的100mLPDB液體培養基中［4］，28℃下靜止培養5d，真空抽濾去掉培養液，40℃烘干12h后稱菌絲體干重。每處理3次重復。

碳、氮源對病原菌生長及菌核形成的影響基礎培養基配方：磷酸二氫鉀1g、氯化鉀0．5g、硫酸鎂0．5g、硫酸鐵0．01g、瓊脂粉17g、水1000mL。測試不同碳源時，在1000mL基礎培養基中加入2g硝酸鉀作為氮源，再分別加30g不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D－海藻糖、甘露醇、木糖醇、鼠李糖、L－阿拉伯糖、D－果糖、D－山梨糖、D－半乳糖、可溶性淀粉、菊糖）；測試不同氮源時，在1000mL基礎培養基中加入20g葡萄糖作為碳源，再分別加入2g不同氮源（甘氨酸、L－組氨酸、脲、L－胱氨酸、DL－丙氨酸、氯化銨、硝酸鈉、磷酸二氫銨）。按1．4．1方法將菌株Sr－1轉接至含有不同碳、氮源的培養基平板中央，28℃下培養3d，用十字交叉法測量菌落直徑，并計算3個重復的平均值，平均值減去5mm作為病原菌實際生長的菌落直徑。10d后統計菌核數量并測量其直徑，每處理3次重復。天然培養基對病原菌生長及菌核形成的影響供試4種天然培養基分別為PDA、肉汁胨培養基（牛肉膏3g、蛋白胨8g、蔗糖10g、瓊脂16g、自來水1000mL）、玉米粉瓊脂培養基（玉米粉300g、瓊脂16g、自來水1000mL）、燕麥片瓊脂培養基（燕麥片30g、瓊脂16g、自來水1000mL）。供試菌株與測試方法同1．4．3。

結果與分析

病害發生與癥狀芝麻白絹病主要發生在芝麻主莖基部及根部。發病初期植株葉片自下而上漸萎蔫（圖1a），濕度大時在近地表莖基部及根部生白色絹絲狀物，后期由白色菌絲體發育產生菌核（圖1b），幼苗期顯癥病株一般數日內死亡。縱剖病株主莖基部，可見韌皮部凹陷，木質部發生褐變（圖1c），將病根泥土清洗并在室溫下保濕5～7d后產生菜籽大小、先白色后黃色、最后為褐色的菌核。在病組織上產生的菌核多為球形或不規則形，直徑0．5～1．0mm，內部白色。該病在芝麻苗期至開花結果期均可發生。

病原菌致病性將菌株Sr－1接種芝麻植株后第16d，12株接菌核或菌餅的芝麻植株均發病，并產生與田間自然發病植株相似的癥狀，而對照植株均無發病癥狀。發病植株根部有放射狀白色菌絲體，后期菌絲集結形成褐色菌核。重新分離得到的菌核與原接種菌株Sr－1的菌核在PDA平板上28℃下培養3d，兩者菌落的形態和菌核大小基本一致。表明菌株Sr－1對芝麻植株有致病性。

病原菌形態菌株Sr－1在PDA平板上菌落圓形，菌絲白色絹絲狀，并呈輻射狀向四周擴展，28℃培養3d即可長滿直徑70mm的PDA平板，7d左右菌落表面開始形成白色菌絲團，菌核開始形成，10d后菌核大量形成。菌核先為白色，后漸變黃色，最后變成褐色，內部灰白色，球形或不規則形，表面光滑且有光澤，直徑為0．5～1．2mm。

分子鑒定用通用引物ITS1和ITS4對菌株Sr－1的rDNA－ITS序列進行擴增，經1％瓊脂糖凝膠電泳后，顯示約650bp的單一條帶（圖2）。產物經純化、測序后，獲得642bp的rDNA－ITS片段（GenBank登記號：JQ982485）。

溫度對病原菌生長及菌核形成的影響表1結果表明，該菌的生長溫度范圍為13～37℃，在31℃下菌落的直徑最大，在22～34℃生長較快，且能產褐色成熟菌核。因此，可將22～34℃視為該菌的適宜生長溫度，31℃為最適生長溫度。低于13℃或高于37℃菌絲停止生長，且低于22℃或高于34℃都不產生成熟菌核。將菌株Sr－1的rDNA－ITS序列與GenBank中已有的相關DNA序列進行比較發現，芝麻白絹病病菌與羅氏阿太菌Atheliarolfsii（無性態：齊整小核菌Sclerotiumrolfsii）有89％～98％的最大相似性。在構建的基于rDNA－ITS序列系統發育樹（圖3）中，菌株Sr－1與羅氏阿太菌相聚于同一群。結合病原菌的形態特征、rDNA－ITS同源性及系統發育樹的分析結果，將菌株Sr－1鑒定為羅氏阿太菌Athelrolfsii（Curzi）C．C．Tu＆Kimbr。

不同酸堿度對病原菌生長的影響菌株Sr－1在pH4．0～9．0范圍內均可生長，其中在pH6．5～7．0中生長最好，表明弱酸性至中性有利于芝麻白絹病菌生長。由圖4中可以看出，在pH6．5以下的酸性區域中，菌絲體的生長量隨pH的增大而平緩上升，而在pH7．0以上的堿性區域中，菌絲體的生長量隨pH增高而下降的幅度相對較大。該結果表明，與酸性環境比較，堿性環境不利于該菌生長。

碳、氮源對病原菌生長與菌核形成的影響菌株Sr－1在13種供試碳源培養基上均能生長，但不同碳源對該菌生長及菌核形成的影響程度有明顯差異。在以D－海藻糖和D－山梨糖各自作為唯一碳源并配與硝酸鹽為氮源的生長條件下，培養3d不僅菌落最大（菌落直徑均大于83mm），且培養至第10d形成的菌核數量最多（表2）；其次具有較大菌落生長量且形成菌核的碳源是木糖醇、甘露醇、鼠李糖和D－半乳糖；在以可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、L－阿拉伯糖、D－果糖和菊糖作為唯一碳源并配與硝酸鹽為氮源的培養基上菌株Sr－1可不同程度地進行營養生長（菌落直徑46．5～75．5mm），但培養至第10d觀察不到菌核的產生。在不同碳源合成培養基上形成的菌核的平均直徑為0．6～0．8mm。8種供試氮源對菌株Sr－1的營養生長和菌核形成的影響也有明顯差異（表3）。該菌在以L－組氨酸、硝酸鈉、DL－丙氨酸作為唯一氮源并配以葡萄糖為碳源的合成培養基上生長速度最快，培養3d菌落直徑大于51mm，但培養至第10d仍不產生菌核；而在以磷酸二氫銨或氯化銨為氮源的培養基上，雖然培養3d菌落直徑小于50mm，但培養至第10d時可產生菌核。在不同氮源合成培養基上形成的菌核的平均直徑為0．6～0．7mm。

不同天然培養基對病原菌生長及菌核形成的影響菌株Sr－1在4種不同的天然培養基（燕麥、肉汁胨、玉米、PDA）上均可生長且形成菌核，其中在PDA和燕麥培養基上培養3d菌落直徑最大（大于71mm），在PDA上培養至第10d產生的菌核數量最多（平均284粒／皿），平均菌核直徑最大（1．2mm），而在燕麥培養基上產生的菌核數量最少（平均15粒／皿）。在玉米培養基上的菌落生長量及形成的菌核數僅次于PDA，在肉汁胨培養基上形成的菌核數介于玉米培養基和燕麥培養基之間。這4種天然培養基上形成的菌核的平均直徑為0．9～1．7mm（表4），均大于各種碳、氮源合成培養基上形成的菌核平均直徑（0．6～0．8mm）。

結論與討論

關于芝麻白絹病菌的分子鑒定及生物學特性研究，很少見有文獻報道。但對齊整小核菌（Sclerotiumrolfsii）引起的其他作物白絹病的報道較多。該菌可侵染62科200多種植物［5］，如草莓［6］、山楂［3］、花生［7］、辣椒［8］、韭菜［9］、油茶［10］、白術［11］、苜蓿［12］、茉莉［13］、煙草［14］等，在不同地區引起不同作物的白絹病。根據柯赫氏法則對芝麻白絹病菌的致病性進行測定，根據病原菌的形態特性及rDNA－ITS序列，將供試菌株Sr－1鑒定為羅氏阿太菌Atheliarolfsii（無性態：Sclerotiumrolfsii，異名：Corticiumcentrifugum）。關于芝麻白絹病，國內文獻記載臺灣、廣西及湖北有分布［2］。該病在河南及其以北省份未見發生報道。本次調查，首次確認河南省有芝麻白絹病的分布，并在國內首次用分子技術對該病的病原菌進行鑒定。Atheliarolfsii屬土傳性病原菌，腐生性強。Nalim等［15］從花生田分離獲得25個菌絲親和組（MCG），組內的分離株菌絲間有親和性，同一株花生可以分離到1～5個MCG，但一個MCG只能侵染一株植株。該菌適宜生長溫度為22～34℃，并易形成菌核，抵抗不良環境，隨著溫度的降低其生長的強度也降低，這與田間高溫時白絹病害發病嚴重的情況相符合。芝麻白絹病菌與韭菜白絹病菌［9］同屬于一個種，因此，生物學具有一些相同之處，如兩者生長的最適溫度均為31℃，其次芝麻白絹病菌在pH4．0～9．0范圍內均可生長，韭菜白絹病菌菌絲生長pH范圍為2．0～9．0，這均與前人報道的病菌在pH4．05～8．97范圍可生長基本相符［6］。但由于病原菌寄主的差異，芝麻白絹病菌的最適生長pH值為6．5，這與韭菜白絹病菌生長的最適pH3～4不同。

研究表明芝麻白絹病菌能廣泛利用碳氮源，但對不同碳氮源的利用有較大差異。在13種測試碳源中，最大菌落與最小菌落平均直徑的差異高達41．5mm；8種測試氮源中，最大菌落與最小菌落平均直徑相差11．0mm，說明不同碳源對該菌生長的影響明顯大于氮源。姚圣海等［16］報道了堿性肥料（尿素、碳酸氫銨、碳酸鉀）和中性肥料（硝酸鈣、硝酸鉀）能抑制菌核的萌發。Gubitz等［17］和Sachslehner等［18～20］的研究發現，花生白絹病菌能夠分泌一些分子量大（40～60kDa）、在酸性條件下性質穩定的酶類，如甘露糖甘酶、甘露聚糖酶等，從而使得白絹病菌能夠很好地利用碳源，促進其生長。因此，不同酸堿度的肥料的施用對芝麻白絹病發生的影響值得進一步探討。本次共測試了13種碳源及8種氮源對芝麻白絹病菌生長及菌核形成的影響。在13種碳源中，有7種（可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、L－阿拉伯糖和菊糖）在與硝酸鹽作為氮源的組配條件下，芝麻白絹病菌雖然能生長，但不形成菌核；然而，在氮源測試中，病原菌在銨鹽與葡萄糖的組合條件下仍可以產生菌核。該結果表明：芝麻白絹病菌的營養生長（vegetativegrowth）階段與菌核形成（sclerotialformation）階段對碳氮源組合有著不同要求；在不同氮源中，銨鹽屬速效氮源，比硝酸鹽及其他有機氮更易被該菌用于菌核形成所需的蛋白質。在碳氮源測試中所用的培養基均為成分明確的合成培養基。芝麻白絹病菌在合成培養基上產生的菌核平均數量均低于40粒／皿，且菌核的平均直徑均小于0．9mm。而在4種天然培養基中除了燕麥培養基的菌核數量較少之外，其它3種（肉汁胨、玉米、PDA）的菌核數均遠多于合成培養基，且天然培養上形成的菌核的平均直徑均大于0．9mm。該結果表明，營養全面、充足的天然培養基有利于芝麻白絹病菌形成更多、更大的菌核。

作者：王雅黃思良何朋朋牛小瑞黎起秦單位：．廣西大學農學院南陽師范學院生命科學與技術學院