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本文作者：周永春王熙才陳艷金從國劉馨姚乾黃尤光陳曉群伍治平黃云超作者單位：昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所

實時熒光定量PCR擴(kuò)增效率評價及實驗細(xì)胞株的篩選

本研究前期共提取了10株肺癌細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞的總RNA，各組細(xì)胞總RNA的D260/D280均為1.9～2.1，提示RNA純度較高；1%RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其RNA完整性較好，適合作為RT-PCR模板。在RNA反轉(zhuǎn)錄后，取倍比稀釋的sox4和GAPDHcDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增效率評價，結(jié)果顯示sox4和內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增曲線相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，符合使用2－ΔΔCt方法分析sox4mRNA相對表達(dá)量的前提條件。以人肺上皮細(xì)胞LEC作為校正，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與肺腺癌細(xì)胞A549以及GLC、人胎肺細(xì)胞KMB-17、人肺腺癌細(xì)胞H157、個舊肺鱗癌細(xì)胞YTMLC、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460和高轉(zhuǎn)移性大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460SM相比，宣威女性肺癌細(xì)胞XWLC-05中的sox4mRNA表達(dá)水平最高（圖1），因此選用該細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

高干擾效果sox4-siRNA的篩選及其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后sox4表達(dá)的變化

PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA2的XWLC-05細(xì)胞中sox4mRNA的表達(dá)無明顯變化，而轉(zhuǎn)染sox4-siRNA1和sox4-siRNA3的XWLC-05細(xì)胞中sox4mRNA的表達(dá)水平明顯降低，其中sox4-siRNA3的抑制率最高（圖2A），因此選用sox4-siRNA3進(jìn)行后續(xù)實驗。實時熒光定量PCR檢測sox4-siRNA3轉(zhuǎn)染XWLC-05細(xì)胞后24、48和72h時，sox4mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，24h時，實驗組與空白對照組和陰性對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；48h和72h時，實驗組細(xì)胞中sox4mRNA的表達(dá)水平與陰性對照組和空白對照組相比均明顯降低（48h時的P值分別為0.000和0.001，72h時的P值分別為0.000和0.001），其中以轉(zhuǎn)染后48h時的抑制作用最為明顯（圖2B）。空白對照組與陰性對照組轉(zhuǎn)染后48h和72h時的sox4mRNA表達(dá)水平無明顯差異（P值分別為0.815和0.506）。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果亦顯示，sox4-siRNA3轉(zhuǎn)染后24、48和72h時，實驗組細(xì)胞中sox4蛋白的相對表達(dá)水平分別為0.203±0.034、0.046±0.026和0.092±0.018。其中，24h時各組之間的sox4蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；48h和72h時，實驗組與空白對照組和陰性對照組相比，sox4蛋白表達(dá)水平明顯下降（48h時的P值分別為0.000和0.003，72h時的P值分別為0.044和0.031），其中以轉(zhuǎn)染后48h時的下降幅度最為明顯（圖2C）。空白對照組和陰性對照組各時段sox4蛋白的表達(dá)無明顯差異（P值分別為0.111、0.077和0.101）。

抑制sox4表達(dá)對XWLC-05細(xì)胞增殖的影響

倒置顯微鏡下觀察實驗組、空白對照組和陰性對照組細(xì)胞均生長良好，呈均一透明的貼壁狀態(tài)，增殖速度、生長密度和大體形態(tài)無明顯差異（圖3A）。MTS法檢測結(jié)果（圖3B）顯示，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA3的實驗組與空白對照組和陰性對照組相比，細(xì)胞增殖無明顯差異（P值分別為0.059和0.113），空白對照組與陰性對照組之間的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.650）。

抑制sox4表達(dá)對XWLC-05細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結(jié)果（圖3C～D）顯示，劃痕后培養(yǎng)48h時，各組細(xì)胞均向劃痕區(qū)遷移，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA組細(xì)胞的遷移距離明顯短于空白對照組和陰性對照組（P值分別為0.000和0.023），空白對照組與陰性對照組之間的遷移距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.090）。Transwell侵襲實驗結(jié)果（圖3E～F）顯示，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA后48h時，實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)為（142.0±4.2）個，與空白對照組和陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均為0.000）；而空白對照組與陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義[分別為（591.0±3.5）個和（559.0±4.9）個，P＝0.372）。實驗組穿膜細(xì)胞經(jīng)染色后，洗脫液的D值與陰性對照組和空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.000和0.001），而陰性對照組與空白對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.566）。上述結(jié)果表明，抑制sox4表達(dá)可顯著降低XWLC-05細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

抑制sox4表達(dá)對XWLC-05細(xì)胞周期及凋亡的影響

FCM檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA348h后，實驗組可見典型的DNA水平小于二倍體的亞G1凋亡峰，凋亡率為（29.12±5.37）%，較空白對照組細(xì)胞凋亡率[（0.46±1.33）%]和陰性對照組細(xì)胞凋亡率[（0.41±2.30）%]顯著升高（P值均為0.000，圖4），而實驗組PI與空白對照組和陰性對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.168和0.225，表3），空白對照組與陰性對照組之間的凋亡率和PI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.733和0.992）。

云南省宣威地區(qū)女性高發(fā)肺癌，近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本院收治的宣威女性肺癌患者除表現(xiàn)為對常規(guī)放化療不敏感的共性外，還顯示出發(fā)病年齡年輕化、轉(zhuǎn)移早、對現(xiàn)有靶向治療不敏感和預(yù)后差的特點(diǎn)。作為轉(zhuǎn)錄因子，sox4除在人類胚胎的發(fā)育和分化中扮演重要角色以外[11]，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也具有重要作用。

在細(xì)胞嚴(yán)謹(jǐn)有序的分化和發(fā)育過程中，sox4基因的突變、缺失或過表達(dá)均可能導(dǎo)致細(xì)胞分化障礙以及增殖和凋亡失控，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。既往研究揭示，sox4在不同類型腫瘤中具有致癌基因的作用[12-15]，也可作為一種抑制因素影響腫瘤的生長[16,17]。這些作用機(jī)制涉及sox4對細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)、對細(xì)胞凋亡的調(diào)控、對微小RNA（microRNA）的表達(dá)調(diào)控以及對細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控等。在肺癌領(lǐng)域，目前的研究多集中于sox4表達(dá)差異及突變方面[10]，最近也有學(xué)者通過高通量芯片技術(shù)致力于探討受sox4調(diào)節(jié)的下游靶基因，并證實小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌中均有sox4的過表達(dá)，受其影響的下游基因多達(dá)123個，且在不同類型的肺癌中存在差異[18]。

然而，目前尚不明確sox4在肺癌生長和轉(zhuǎn)移中的確切機(jī)制。本研究通過對10株不同類型肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)sox4mRNA在正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B和人肺上皮細(xì)胞LEC中呈現(xiàn)低表達(dá)，而在胚胎細(xì)胞KMB-17中呈現(xiàn)高表達(dá)，符合其作為胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)基因的本質(zhì)。此外，與正常肺及支氣管細(xì)胞相比，sox4在各類型肺癌細(xì)胞中均表現(xiàn)為過表達(dá)，推測其與惡性腫瘤細(xì)胞去分化的特點(diǎn)有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，宣威女性肺癌細(xì)胞XWLC-05中的sox4mRNA表達(dá)水平相對較高，因此采用RNA干擾技術(shù)抑制該基因在XWLC-05細(xì)胞中的表達(dá)，試圖探討sox4在宣威肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。XWLC-05細(xì)胞系由昆明醫(yī)學(xué)院病理教研室于2007年建立，是目前唯一以宣威女性肺癌為來源建立的細(xì)胞株，材料取自宣威當(dāng)?shù)匾幻?8歲的女性肺腺癌患者（右肺中分化腺癌）。實驗證明，該細(xì)胞株維持了原腫瘤的表型特征，能夠形成與宣威女性肺癌具有相同形態(tài)學(xué)特征的裸鼠移植瘤[19]。因此，選擇該細(xì)胞作為體外研究的對象，能夠最大程度地反映宣威女性肺癌的生物學(xué)特征。

為了避免只選擇一個序列可能出現(xiàn)RNA干擾無效或低效的情況，本研究選擇了sox4基因編碼序列中3個可能的干擾位點(diǎn)，并篩選出干擾效應(yīng)最強(qiáng)的sox4-siRNA3進(jìn)行實驗，同時通過設(shè)置陰性對照以排除可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，sox4-siRNA能夠在mRNA和蛋白水平顯著降低腫瘤細(xì)胞中sox4的表達(dá)，且抑制效應(yīng)在轉(zhuǎn)染后48h時最強(qiáng)，這與siRNA的瞬時干擾作用相符，因此后續(xù)實驗均選用轉(zhuǎn)染后48h時的細(xì)胞作為研究對象。

MTS法檢測細(xì)胞增殖活性的原理與傳統(tǒng)的MTT法相同，但因為前者不需要對細(xì)胞進(jìn)行沖洗以及額外添加DMSO，也不需要收獲細(xì)胞，可直接進(jìn)行比色，因此兼具了MTT法快速、安全和靈活的特點(diǎn)，同時操作更加簡便，敏感度更高，實驗結(jié)果也更加準(zhǔn)確而可靠[20]。本研究利用MTS法檢測XWLC-05細(xì)胞轉(zhuǎn)染sox4-siRNA后的增殖活性，結(jié)果顯示與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，轉(zhuǎn)染前后顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)也與空白對照組無明顯差異。FCM結(jié)果也顯示，實驗組和對照組細(xì)胞的增殖率無顯著差異，提示sox4可能并不參與調(diào)控XWLC-05細(xì)胞的增殖。不過，轉(zhuǎn)染48h后的FCM檢測結(jié)果卻提示，實驗組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的亞二倍體峰，其凋亡率較空白對照組和陰性對照組明顯升高，提示sox4可能在XWLC-05細(xì)胞的凋亡中起一定的作用，這與Liu等[12]在前列腺癌中的研究結(jié)果一致。

基膜是阻止腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)械屏障，而Matrigel是從富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出的基膜基質(zhì)，主要成分包括層黏連蛋白、膠原Ⅳ、巢蛋白和硫酸肝素糖蛋白等，還包含生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等。在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，可以模擬體內(nèi)細(xì)胞基膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能。本研究結(jié)果顯示，抑制sox4表達(dá)可以降低XWLC-05細(xì)胞對Matrigel的穿膜能力，同時劃痕實驗顯示細(xì)胞遷移率顯著降低，提示sox4與XWLC-05細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān)。結(jié)合FCM檢測結(jié)果，推測抑制細(xì)胞凋亡可能是sox4增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞惡性行為的機(jī)制，但對其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究利用siRNA成功抑制了宣威女性XWLC-05肺癌細(xì)胞中sox4的表達(dá)。體外實驗證實，抑制sox4表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力均下降，雖然細(xì)胞增殖未受到明顯影響，但細(xì)胞凋亡明顯增加。本研究結(jié)果為下一步構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型和動物實驗奠定了基礎(chǔ)，也為以sox4作為肺腺癌治療靶點(diǎn)的研究提供了實驗依據(jù)。