表觀遺傳學的發(fā)展
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表觀遺傳學的發(fā)展范文第1篇
中圖分類號研究生教育是高等教育的重要組成部分，是培養(yǎng)高素質(zhì)、高層次人才的重要手段。今天的社會對研究生的全面素質(zhì)和創(chuàng)新能力提出更高的要求，而專業(yè)課教學是研究生教育的最基本部分，是提高研究生專業(yè)素質(zhì)和創(chuàng)新能力的直接途徑，因此，提高專業(yè)課教學水平對研究生的培養(yǎng)具有十分重要的意義[1]。隨著生物技術(shù)和醫(yī)學科學技術(shù)的迅速發(fā)展，知識更新速度加快，學科之間相互交叉、相互滲透，邊緣學科和新興學科不斷涌現(xiàn)。表觀遺傳學是近幾年來生命科學迅速發(fā)展的前沿學科之一，其理論與技術(shù)已經(jīng)廣泛滲透至生物學、基礎(chǔ)醫(yī)學、臨床醫(yī)學及預(yù)防醫(yī)學的各個學科。表觀遺傳學是我們學院學術(shù)型碩士研究生專業(yè)課程和專業(yè)學位碩士研究生專業(yè)知識模塊的主干課程。如何適應(yīng)新形勢下研究生培養(yǎng)的需要，筆者主要針對研究生表觀遺傳學教學談一些自己的看法及建議。
1 教師業(yè)務(wù)素質(zhì)的提高
生物醫(yī)學模式的轉(zhuǎn)變對教師的業(yè)務(wù)素質(zhì)和能力提出了相應(yīng)的更高要求。不僅要求教師有生命科學、基礎(chǔ)醫(yī)學和臨床醫(yī)學的專業(yè)知識，而且還要有生物醫(yī)學理論方面的知識，同時要求教師的技術(shù)知識層次能跟上生物醫(yī)學實驗技術(shù)推廣周期不斷縮短的趨勢。我們在研究生的表觀遺傳學教學中，隨時進行文獻調(diào)研，密切關(guān)注最新高水平期刊和學術(shù)會議的相關(guān)信息，不斷補充傳達的最新知識。引導(dǎo)學生關(guān)注當前研究活躍的腫瘤、衰老、心血管疾病、感染性疾病與表觀遺傳學的最新研究進展情況，著重介紹營養(yǎng)、環(huán)境、應(yīng)激、細胞代謝在表觀遺傳變化中的重要作用機制。這些新知識非常受研究生的歡迎，引起他們濃厚的興趣。通過這些新知識的學習，不僅開闊了研究生的學習視野，啟發(fā)了他們的創(chuàng)新思維，同時使他們形成良好的文獻調(diào)研和學術(shù)研討的習慣，逐步形成和掌握正確的科研方法，為即將開展的課題研究工作奠定了堅實的基礎(chǔ)。在教學過程中反過來能進一步促進教師知識結(jié)構(gòu)的不斷更新，達到教學相長的目的。
2 改革教學內(nèi)容，形成完整的表觀遺傳學知識結(jié)構(gòu)體系
與經(jīng)典遺傳學以研究基因序列決定生物學功能為核心相比，表觀遺傳學主要研究基于染色質(zhì)事件對于這些“表觀遺傳密碼”的建立和維持的機制，及其如何決定細胞的表型和個體的發(fā)育。在表觀遺傳學研究生課堂教學過程中必須具有一定的前瞻性，引導(dǎo)研究生關(guān)注表觀遺傳學學科的發(fā)展動態(tài)，密切注意學科的交叉和延伸，緊跟表觀遺傳學的發(fā)展方向和學科發(fā)展的突破點。課堂教學過程中把最主要的精力放在表觀遺傳學學科領(lǐng)域發(fā)展最活躍最富潛力的研究方向上，例如表觀遺傳機制在癌癥等疾病中的作用機制，細胞代謝與表觀遺傳變化的關(guān)系等。表觀遺傳學是生命科學中一個普遍而又十分重要的新研究領(lǐng)域。它不僅對基因表達、調(diào)控、遺傳有重要作用，而且在腫瘤、免疫、病毒感染復(fù)制等許多疾病的發(fā)生和防治中亦具有十分重要的意義。在教學過程中主要內(nèi)容包括：表觀遺傳學概論，DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質(zhì)重塑，基因組印記，X染色體失活，siRNA與miRNA介導(dǎo)的調(diào)控，表觀遺傳學與疾病，表觀遺傳學與癌癥，天然產(chǎn)物及中草藥的發(fā)展對表觀遺傳學的展望，表觀遺傳學的治療進展。上述內(nèi)容形成完整的表觀遺傳學知識結(jié)構(gòu)體系。在教學過程中，通過有選擇地插入一些小型專題講座及相關(guān)的研究歷史背景資料的方式，介紹和強調(diào)學習和掌握表觀遺傳學的重要性，既活躍了課堂，又把課程從枯燥的理論講解中解放出來，同時激發(fā)了研究生的學習積極性，拓寬相關(guān)的知識面[2]。同時在教學過程中注重前沿進展內(nèi)容的加入，如代謝、營養(yǎng)、環(huán)境等影響因素與表觀遺傳學的相關(guān)進展。
3 改革教學方法，培養(yǎng)研究生的創(chuàng)新能力
本課程所授課的對象是已具備一定自學能力和學習主動性的研究生，最重要的是培養(yǎng)他們科學地發(fā)現(xiàn)并解決問題的能力、準確表達個人思想見解的能力以及科研創(chuàng)新能力。本課堂選課人數(shù)一般在十人左右，因此課堂教學的特點在于小班授課。由于是小班教學，增加了教學的靈活性和增強了師生之間互動的可能性，師生之間的交流與溝通增多。因此在教學過程中采用教師課堂授課、學生參與研討、學生講授等多種教學方式，強調(diào)講授、研論、文獻調(diào)研、學術(shù)講座、論文報告、文獻綜述等多種方式并重的原則。在教學過程中，合理安排時間，讓研究生充分參與到教學的研討，結(jié)合自己的研究方向發(fā)表自己獨特的見解，闡述自己的學術(shù)觀點，這種教學方式為研究生迅速進入科研工作的角色奠定了堅實的基礎(chǔ)，增強了研究生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。發(fā)揮現(xiàn)代多媒體技術(shù)在教學中的重要作用，電子課件與板書相結(jié)合，同時采用圖片、視頻播放、動畫等多種方式的應(yīng)用。倡導(dǎo)啟發(fā)式教育，摒棄灌輸式教學方法，講授基本理論知識的同時注意結(jié)合科研最新進展情況拓寬學生知識面，加強學生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，使學生的理論基礎(chǔ)和實踐應(yīng)用能力同步得到提高，取得了較好的教學效果。對由于受學時限制而不能在課堂上詳細介紹的前沿內(nèi)容可使用討論法，安排學生課后自學，啟發(fā)學生提出問題，通過課堂討論得到解決。還可以在部分單元結(jié)束后，要求研究生根據(jù)自己的專業(yè)方向，結(jié)合查閱最新的文獻資料，撰寫小專題報告，組織交流討論，以便鞏固學生所學知識，并進一步拓寬知識面。研究生不同于本科生，他們有強烈的求知欲孥，有較高的學習熱情，有較強的自學能力，所以在教學中倡導(dǎo)自學，組織討論，是因材施教、培養(yǎng)研究生創(chuàng)新能力的好方法。
4 多種考核方式結(jié)合，檢驗教學效果。
在研究生的考核方面，不僅僅局限于對課內(nèi)授課內(nèi)容的掌握程度，還可以采用綜述、專題小報告、PPT匯報、模擬課題設(shè)計等綜合考核方式，注重知識的活學活用和創(chuàng)新意識的培養(yǎng)，這樣才有利于研究生即打好廣博、堅實的理論基礎(chǔ)，又能其重組知識框架，只有這樣，研究生的創(chuàng)新意識才能夠得到增強。
研究生創(chuàng)新能力培養(yǎng)是受多因素復(fù)雜交錯影響的，要提升研究生的創(chuàng)新能力，既要保證培養(yǎng)研究生的客觀條件充足，又要發(fā)揮研究生的主觀能動性。研究生教育只有適應(yīng)知識經(jīng)濟時代的要求，才能不斷培養(yǎng)出符合社會需要的高層次創(chuàng)新型人才。表觀遺傳學既是目前迅速發(fā)展的學科和熱點領(lǐng)域，在生物醫(yī)學各種學科存在著千絲萬縷的聯(lián)系。它也是我們學院研究生重要的專業(yè)基礎(chǔ)課，對于培養(yǎng)研究生的創(chuàng)新意識，培養(yǎng)研究生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力具有重要的作用。只有在教學實踐中不斷地提高教師自身素質(zhì)，調(diào)整教學內(nèi)容，改進教學方法，才能達到預(yù)期目的。
參考文獻
表觀遺傳學的發(fā)展范文第2篇
基因組印記
基因組印記是一種不遵循傳統(tǒng)孟德爾遺傳規(guī)律的表觀遺傳現(xiàn)象。這是由于來源于某一親本的等位基因或其所在的染色體發(fā)生了表觀遺傳修飾，導(dǎo)致不同親本來源的兩個等位基因在子代細胞中表達不同。受印記機制調(diào)控而差異表達的基因稱之為印記基因（imprintedgene）。目前在植物、昆蟲和哺乳動物中均發(fā)現(xiàn)了基因組印記現(xiàn)象，而在鳥類、魚類、爬行類和兩棲類動物普遍認為不存在印記現(xiàn)象。1991年Bartolomei等采用基因敲除技術(shù)在小鼠中首次確認了類胰島素生長因子2型受體和非編碼RNAH19基因兩個母源印記基因及一個類胰島素生長因子2型父源印記基因。2007年，杜克大學的研究人員用機器學習的人工智能形式發(fā)現(xiàn)了156個新的印記基因，并以此為基礎(chǔ)創(chuàng)造了第一張人類基因組印記基因圖譜。
X染色體失活
X染色體失活是指雌性哺乳類細胞中兩條X染色體的其中之一失去活性的現(xiàn)象，X染色體會被包裝成異染色質(zhì)，進而因功能受抑制而沉默化，這種現(xiàn)象也稱為X染色體的劑量補償（dosagecompensation）。X染色體失活的起始和選擇發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期，這個過程被X染色體失活中心（X-inactivationcenter，XIC）所控制，是一種反義轉(zhuǎn)錄的調(diào)控模式。這個失活中心存在著X染色體失活的特異性轉(zhuǎn)錄基因，當失活命令下達時，這個基因產(chǎn)生1個17kb不翻譯的RNA與X染色體結(jié)合，介導(dǎo)DNA甲基化和組蛋白修飾，引發(fā)并維持X染色體的失活。X染色體失活中心還有“記數(shù)”功能，即保持每個二倍體中僅有1條X染色體有活性，其余全部失活。X染色體的失活狀態(tài)需要表觀遺傳修飾來維持，可以通過有絲或減數(shù)分裂遺傳給后代。
非編碼RNA
非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白質(zhì)的功能性RNA分子，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA等多種已知功能的RNA以及未知功能的RNA。按照它們的大小可分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA，前者在基因簇以至于整個染色體水平發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，后者在基因組水平調(diào)控基因表達并介導(dǎo)mRNA的降解，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，決定細胞的分化命運，還對外源的核酸序列有降解作用以保護本身的基因組。microRNA是一類內(nèi)源產(chǎn)生的長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA分子，廣泛存在于真核生物甚至病毒中，通過調(diào)節(jié)編碼蛋白的基因的表達或翻譯來發(fā)揮調(diào)控作用。microRNA的功能十分廣泛并且滲入到了生理病理學的各種調(diào)控途徑中，包括發(fā)育周期、細胞增殖和分化、細胞凋亡、新陳代謝、神經(jīng)調(diào)控、腫瘤發(fā)生以及病毒和宿主的相互作用等。在法醫(yī)學應(yīng)用中，由于降解后的片段長度過小，不能進行有效的PCR擴增，然而microRNA就能滿足降解檢材的PCR擴增，開始成為關(guān)注的熱點。
表觀遺傳學在法醫(yī)學中的應(yīng)用
1表觀遺傳學與親權(quán)鑒定
自1985年英國遺傳學家AlecJeffreys教授首次報道DNA指紋圖技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)DNA分析以來，DNA分析技術(shù)已經(jīng)在多起重大的刑事犯罪偵破和民事訴訟中發(fā)揮重要的作用。目前主要是以熒光標記STR與SNP等傳統(tǒng)遺傳標記進行個體識別和親權(quán)鑒定。但在法醫(yī)學親子鑒定中，尤其是子代為雜合子或者父（母）和子代為相同的雜合子的單親鑒定中，親代的必需等位基因可能無法確定，使基因座的鑒別能力下降。但通過使用親緣特異性甲基化遺傳標記可以直接判定等位基因的親源，從而確定親代的必需等位基因。Zhao等應(yīng)用甲基化特異性PCR對被甲基化標記的母系SNP位點rs220028進行檢測證明了這一觀點。另外，Poon等報道，采用DNA甲基化標記可有效識別孕婦外周血中的胎兒DNA，這也為產(chǎn)前的親權(quán)鑒定提供了一種非侵入性的檢測方法。
2表觀遺傳學與年齡推斷鑒定
個體年齡推斷一直是法醫(yī)學研究的重要內(nèi)容。目前實際工作中，個體年齡推斷主要依據(jù)人類學方法，通過測量與年齡相關(guān)的骨骼、牙齒標志等，根據(jù)相關(guān)模型進行推算。近年來，許多研究者發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學為個體年齡推斷的研究提供了一種新的思路。DNA甲基化隨年齡變化的特點為利用甲基化標記進行年齡推斷提供了可能。陳培利等利用人胚肺二倍體成纖維細胞（humanembryoniclungdiploidfibroblast，2BS）進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其p16基因啟動子區(qū)及外顯子Ⅰ處的DNA甲基化水平隨個體細胞代齡的增加而降低。Tra等用限制性標記基因組掃描（restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS）技術(shù)對T淋巴細胞2000個基因座的甲基化年齡變化情況進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)29個基因座有變化，其中23個增加，6個降低。由于甲基化標記數(shù)目眾多，從中可以篩選出一組適合于法醫(yī)學應(yīng)用的、年齡變化有規(guī)律的座位，應(yīng)用于微量檢材的年齡推斷。尹慧等用高效液相色譜（HPLC）法對94個健康個體DNA甲基化水平的檢測發(fā)現(xiàn)，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）含量隨年齡增加而降低，50歲以上與50歲以下年齡組5mC含量差異具有統(tǒng)計學意義。2010年，Teschendorff等通過對261個絕經(jīng)后婦女全血樣本約14000個基因啟動子區(qū)超過27000個CpG的甲基化狀態(tài)進行分析，證實干細胞多梳蛋白家族（polycombgroup，PcG）靶基因比非靶基因更容易隨年齡發(fā)生甲基化，并且變化不依賴于組織類型、疾病狀態(tài)和甲基化水平。
Bocklandt等通過分析唾液中的DNA甲基化標記，可以預(yù)測一個樣本組成員的年齡，結(jié)果與實際年齡相差大約在5歲范圍內(nèi)。這項技術(shù)如果被確證，可能會成為法醫(yī)取證方面很有用的一種工具。同時，它還表明了一種可能性：DNA甲基化修飾或許可以提供一種比計算生日更具醫(yī)學相關(guān)性的年齡測定方法。
2010年，NorenHooten等在外周血單核細胞中的800個microRNA標記中篩選出9個與年齡相關(guān)的基因，但發(fā)現(xiàn)其中5個與疾病有關(guān)，該研究表明microRNA可以作為推斷年齡以及和年齡相關(guān)疾病的診斷指標。
2011年，國內(nèi)Jin等首次報道了通過體細胞發(fā)揮功能的組蛋白修飾基因?qū)λダ线@一重要生物學過程的調(diào)控作用。這項研究通過生物化學、分子生物學、遺傳學和系統(tǒng)生物學相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)組蛋白H3K27me2/3去甲基酶UTX-1/UTX對衰老發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。在秀麗線蟲中，該基因的雜合突變體及野生型的RNAi敲降后都能極大地延長線蟲壽命，使其抗逆性也大大加強。遺傳學分析發(fā)現(xiàn)其功能依賴于胰島素樣信號通路。這種通過重新建立組蛋白修飾模式的方式，揭示了細胞的重編程在抑制衰老過程中的重要作用，并提示其作用機制在哺乳動物細胞中同樣存在。
3表觀遺傳學與雙生子的鑒別
同卵雙生子（monozygotictwins，MZ）是由一個受精卵經(jīng)過卵裂產(chǎn)生兩個單獨的細胞，并發(fā)育為完全獨立的個體，因此同卵雙生兩個個體的遺傳背景完全相同，享有共同的DNA序列。在法醫(yī)DNA分析領(lǐng)域，現(xiàn)有的DNA分析手段尚不能有效鑒別同卵雙生個體。
但是近年來，眾多研究都已證實，同卵雙生子的表觀遺傳學水平存在一定的差異。Fraga等對西班牙的40對同卵雙生子個體進行研究，發(fā)現(xiàn)他們在DNA甲基化、X染色體失活、組蛋白位點特異性乙酰化上存在差異，并且這種差異會隨年齡增長而增加。Kaminsky等對114對同卵雙生子個體的DNA甲基化的研究顯示，血白細胞、口腔黏膜上皮細胞和腸道組織中的甲基化狀態(tài)均存在差異。
此外，Ollikainen等對新生兒不同組織相關(guān)的4個差異甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行了研究，發(fā)現(xiàn)甲基化水平存在顯著差異。從上述研究成果中可以看出，研究人員已經(jīng)把目光投入到了法醫(yī)DNA分析的全新領(lǐng)域，尤其是DNA甲基化在同卵雙生子中的研究。這些都為采用DNA甲基化這一表觀遺傳學標記進行同卵雙生子個體甄別的可能性提供了強有力的理論支撐。
4表觀遺傳學與組織來源鑒定
在常見的法醫(yī)學案件中，有時需要對生物檢材的組織來源進行鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)和生化方法信息含量少，容易受各種條件的影響，因此常常受到限制。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，以表觀遺傳學為基礎(chǔ)的組織鑒定方法存在明顯優(yōu)勢，越來越為人們所關(guān)注。
例如，富含CpG的Alu重復(fù)序列，在體細胞中是甲基化的，在生殖細胞中卻是低甲基化的，有一個在進化上比較年輕的Alu亞族在中幾乎是完全沒有甲基化的。通過對這一Alu亞族甲基化的分析，就可以判斷檢材是否含有。范光耀應(yīng)用聯(lián)合亞硫酸氫鹽的限制酶法，調(diào)查、常見體液、分泌液和組織的DEAD盒多肽4［DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）boxpolypeptide4，DDX4）］基因啟動子甲基化水平，發(fā)現(xiàn)中的甲基化水平顯著高于非組織。因此，選擇一個合適的界值，可以根據(jù)DDX4甲基化水平有效地鑒別（斑）的種屬來源。
Hanson等運用RT-PCR技術(shù)，根據(jù)microRNA的細胞組織特異性對血液、、唾液、陰道分泌液和經(jīng)血進行來源鑒別，并通過與21種人體組織比對驗證了各種斑痕microRNA表達的特異性，用于檢測RNA的模板量最低可達50pg。Zubakov等運用微陣列和Taqman定量PCR技術(shù)確證了一些能運用于法醫(yī)學實踐識別血痕和精斑的穩(wěn)定的microRNA標記。該項研究不僅將靈敏度提高到相當于單細胞水平的0.1pgRNA模板量，而且在新鮮與陳舊樣本的比對中發(fā)現(xiàn)其microRNA分子絕對含量未發(fā)生明顯變化。
5其他
近年來，隨著學者們對RNA在法庭科學領(lǐng)域的研究逐漸廣泛和深入，發(fā)現(xiàn)microRNA在法醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用價值也日益重要。2007年王芬等發(fā)現(xiàn)有6個microRNA分子在H2O2誘導(dǎo)PC12細胞凋亡后表達顯著下調(diào)，這一結(jié)果為法醫(yī)病理學者研究腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)細胞凋亡的機制提供了理論依據(jù)。2010年李文燦等在研究大鼠心肌組織microRNA降解與死亡時間的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，其含量在機體死后120h內(nèi)保持相對穩(wěn)定的水平，可作為內(nèi)參指標反映其他生物指標的變化水平。
隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，法醫(yī)工作者又面臨一項新的挑戰(zhàn)，即如何在日常的親緣鑒定和個體識別工作中有效甄別偽造DNA。用于偽造DNA常使用PCR擴增的方法，因此使用親緣特異性甲基化遺傳標記，可以在進行親子鑒定和個體識別的同時，檢測樣本的甲基化狀態(tài)，從而鑒別樣本是否為人工偽造DNA。因此DNA甲基化遺傳標記在鑒定DNA是否人工偽造中發(fā)揮著重要的作用。
表觀遺傳學的發(fā)展范文第3篇
[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；DNA甲基化；表觀遺傳學；生物學標志
[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2013）08（b）-0028-03
結(jié)直腸癌是全世界癌癥死亡的主要原因之一，它的發(fā)生由一系列遺傳學及表觀遺傳學方面的改變使正常的上皮組織發(fā)展為浸潤性癌的過程。這個過程首次在Fearon和Vogelstein設(shè)計的典型的腺瘤癌癥發(fā)展模型中被提出[1]。該模型的提出，使我們對結(jié)直腸癌分子發(fā)病機制的認識大幅提高，目前認為結(jié)直腸癌的發(fā)生涉及多種分子通路，包括基因突變和表觀遺傳學改變[2]。過去十年，關(guān)于腫瘤表觀遺傳學的研究已取得了重大的進步，特別是DNA異常甲基化方面。對結(jié)直腸癌表觀遺傳學進行研究，可進一步揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，為結(jié)直腸癌臨床診斷、治療和預(yù)后評價提供重要生物學標志。
1 表觀遺傳學簡介
表觀遺傳學是指不涉及DNA序列改變的情況下，基因的表達與功能發(fā)生改變并產(chǎn)生可遺傳的表型。基因表達的表觀遺傳學調(diào)控發(fā)生于正常的組織，在胚胎發(fā)育、基因印記和組織分化中發(fā)揮重要作用[3]。異常的表觀遺傳學改變最早于1982年在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，從此開啟了對表觀遺傳學研究的熱潮，包括調(diào)控正常組織和癌組織中基因表達的一系列復(fù)雜的表觀遺傳調(diào)節(jié)機制[4]。表觀遺傳學修飾很大程度上影響著核染色質(zhì)凝固狀態(tài)，決定了DNA能否正常表達蛋白質(zhì)，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄。“開放”的染色質(zhì)狀態(tài)可進行基因轉(zhuǎn)錄，相反，濃縮或者“關(guān)閉”的染色質(zhì)狀態(tài)阻止基因轉(zhuǎn)錄[3]。目前在腫瘤形成中發(fā)揮重要作用的表觀遺傳學機制有以下幾方面：①CpG島區(qū)域胞嘧啶的DNA甲基化；②組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾；③siRNA和miRNA；④核小體定位[3]。在這篇綜述里將重點介紹DNA甲基化，因為它在結(jié)直腸癌表觀遺傳學調(diào)控機制中研究的最為廣泛。
2 DNA甲基化及其在大腸癌發(fā)病機制中的作用
2.1 DNA甲基化
DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化S腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶的反應(yīng)[5]。通常，最易被DNMT作用的是CG二核苷酸序列，即CpG。正常哺乳動物細胞的大多數(shù)CpG序列存在甲基化，非甲基化CpG序列僅存在DNA的CpG島區(qū)域。CpG島通常被定義為GC含量大于50%，長度大于200～500個堿基的一段序列，并且觀測到的CpG比例較預(yù)測的比例高0.6[6]。60%～70%的基因啟動子區(qū)域含有CpG島，并且處于非甲基化狀態(tài)，在腫瘤中，他們發(fā)生異常甲基化。啟動子區(qū)域CpG島的甲基化與轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)，發(fā)生在基因啟動子區(qū)域以外CpG位點的甲基化稱為基因體甲基化，與轉(zhuǎn)錄失活無關(guān)，而與轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)[7]。
基因的甲基化模式對基因表達的調(diào)控至關(guān)重要。CpG甲基化可以通過多種機制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活，如直接抑制順式作用原件AP-2、CREB、E2F等[8]。DNA甲基化的一個重要機制是通過與調(diào)節(jié)核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶合作交互調(diào)控基因表達。這種合作交互機制與一種甲基結(jié)合蛋白（PcG）有關(guān)，通過與高親和力的甲基化DNA結(jié)合導(dǎo)致級聯(lián)放大反應(yīng)，招募蛋白質(zhì)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)控組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化及染色質(zhì)重塑，從而使染色質(zhì)固縮并封閉轉(zhuǎn)錄因子到啟動子區(qū)域的通道[9]。DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑之間的相互作用錯綜復(fù)雜，存在各種各樣的串話。異常的DNA甲基化有可能改變?nèi)旧|(zhì)重塑和基因表達，組蛋白及其修飾蛋白的調(diào)節(jié)異常可能導(dǎo)致異常的DNA甲基化。研究表明PcG蛋白復(fù)合體PRC2的異常活化可能是誘導(dǎo)腫瘤中DNA異常甲基化的機制之一[10]。
2.2 DNA甲基化與年齡因素
年齡是結(jié)直腸癌發(fā)生的一個重要危險因素，老化的腸黏膜表現(xiàn)為年齡相關(guān)的整個基因組的低甲基化和某些特定區(qū)域的高甲基化。起初認為組織結(jié)構(gòu)正常的腸上皮細胞上的ESR1、IGF2和TUSC3基因的異常甲基化與年齡相關(guān)，隨后發(fā)現(xiàn)另外一些基因也存在年齡相關(guān)性甲基化[11]。約50%年齡相關(guān)性甲基化基因與結(jié)直腸癌發(fā)病機制相關(guān)的基因是相同的，這表明年齡相關(guān)性基因在增加腫瘤易感性上起到一定的作用。有研究表明年齡相關(guān)性DNA甲基化和腫瘤相關(guān)性DNA甲基化機制可能是相同的，然而年齡相關(guān)性異常甲基化的機制仍不清楚[12]。在老年人正常組織中檢測到異常DNA甲基化提示高齡腸癌患者比低齡者存在更多的表觀遺傳學驅(qū)動事件[13]。
2.3 DNA甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展
目前認為在多數(shù)結(jié)直腸癌基因組中存在成百上千個異常甲基化基因，且只有一部分可能與這些腫瘤的發(fā)生有重要關(guān)系。在正常黏膜向腺瘤，息肉向腫瘤的進展過程中，可以顯而易見地看到發(fā)生甲基化的基因大幅增加，比較正常黏膜和早期腺瘤，早期腺瘤和進展期腺瘤，甲基化基因在不段大幅增加[14]。Esteller[15]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤中MGMT、MLH1等DNA修復(fù)基因的異常甲基化可能促進腺瘤發(fā)生惡變。
Toyota等[16]于1999年提出了這些腫瘤中有一個獨特的分子發(fā)病機制，稱為CpG島甲基化表現(xiàn)型（CIMP），且接近20%的結(jié)直腸癌是CIMP腫瘤。CIMP可在進展期管狀腺瘤中檢測到，但是在管狀腺瘤早期卻不是普遍能檢測到的[15]。目前尚不清楚在息肉形成結(jié)直腸癌的晚期能否檢測到CIMP。另外，CIMP腫瘤中存在高突變率的BRAF基因，并且常發(fā)生在女性的右半結(jié)腸[17-18]。有研究對125例結(jié)直腸癌標本進行了全基因組DNA甲基化性能分析，將CIMP腫瘤分為CIMP-H和CIMP-L，前者表現(xiàn)為異常高頻的腫瘤特異性DNA甲基化，與MLH1甲基化和BRAF突變密切相關(guān)[19]。目前CIMP腫瘤發(fā)生的潛在原因還不清楚，但已表明與吸煙有關(guān)，同時有證據(jù)表明與營養(yǎng)狀態(tài)、體型、身體活動情況等也有一定關(guān)聯(lián)[20]。然而，總體來看，DNA的異常甲基化主要涉及結(jié)直腸癌形成的早期事件，較少涉及進展期事件。
3 DNA甲基化在結(jié)直腸癌臨床應(yīng)用中的價值
3.1 DNA甲基化與結(jié)直腸癌的早期診斷
對于將甲基化基因作為結(jié)直腸癌特異性生物學標志物，目前最先進的用途是基于DNA水平的結(jié)直腸癌的篩查。雖然目前腸鏡仍是結(jié)直腸癌篩查最準確的方法，但是由于該檢查操作程序較復(fù)雜及存在一定的并發(fā)癥，患者依從性欠佳。盡管大便潛血檢查價格便宜且操作簡單，但靈敏性和特異性相對較低。筆者對結(jié)直腸癌分子病理學方面的研究進展，已將這些有應(yīng)用前景的早期檢測分子標記用于結(jié)直腸癌的非侵襲性篩查。啟動子區(qū)域的一些基因在早期結(jié)直腸癌中存在高甲基化，可作為早期檢測標志物。糞便中的甲基化波形蛋白是已得到驗證的結(jié)直腸癌早期檢測標記，人波形蛋白基因（VIM）在53%～84%的結(jié)直腸癌患者中存在異常甲基化，有報道提出靈敏度達到83%，特異性達到82%[21]。另外，在歐洲和中東已將檢測外周血中甲基化SEPT9基因的檢測用于結(jié)直腸癌篩查，目前正不斷地在提高用糞便、血漿進行甲基化分析達到臨床用途的可行性[21]。
3.2 DNA甲基化與結(jié)直腸癌療效及預(yù)后評價
由于CpG島高甲基化和整體DNA的低甲基化之間的相反關(guān)系，對關(guān)于結(jié)直腸癌臨床應(yīng)用的表觀遺傳學標志的研究主要集中在基因的甲基化，本課題組研究發(fā)現(xiàn)TIP30啟動子在高轉(zhuǎn)移性、低分化的大腸癌細胞株HCT116和非高轉(zhuǎn)移性的大腸癌細胞株HT29中存在CpG島高甲基化，這可能是抑癌基因TIP30表達降低或缺失的機制之一[22]，與筆者前期關(guān)于大腸癌組織中TIP30蛋白表達情況[23]及TIP30過表達能抑制大腸癌細胞生長，降低其侵襲、遷移能力[24]等研究結(jié)果相一致。另外，還發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌TIP30啟動子甲基化狀態(tài)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及對5-FU、奧沙利鉑化療藥物的敏感性相關(guān)[22，25]。
Ide等[26]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤CIMP狀態(tài)可作為5-FU反應(yīng)性的預(yù)測標記，然而目前關(guān)于CIMP狀態(tài)與5-FU輔助治療反應(yīng)性之間的尚存在相互矛盾的數(shù)據(jù)。低甲基化的LINE-1作為一種生物學標志已在研究，近來Ahn等[27]研究表明，甲基化的LINE-1有望成為近端結(jié)直腸癌無病生存期較短的預(yù)后指標，且腫瘤復(fù)發(fā)患者LINE-1的甲基化水平較無復(fù)發(fā)者低。然而，迄今為止的數(shù)據(jù)還不足以支持將基因甲基化作為預(yù)測性生物指標。
4 結(jié)論
在過去十年里，表觀遺傳學對腫瘤發(fā)病機制作用的研究取得了飛速發(fā)展，現(xiàn)已明確表觀遺傳學事件是結(jié)直腸癌發(fā)病機制的驅(qū)動事件，表觀遺傳學事件與基因突變共同參與正常腸黏膜向結(jié)直腸癌進展的過程，而且結(jié)直腸癌基因組中受異常DNA甲基化影響的基因較受基因突變影響的基因多。異常DNA甲基化的研究為結(jié)直腸癌的早期診斷、預(yù)后判斷和干預(yù)治療提供了新的思路，并且已經(jīng)展現(xiàn)了良好的前景。
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表觀遺傳學的發(fā)展范文第4篇
關(guān)鍵詞:分子生物學；課程設(shè)計；教學評價；探索
分子生物學是在分子水平上研究生命現(xiàn)象與生命本質(zhì)的科學。作為生命科學的共同語言，主要闡明生物大分子的結(jié)構(gòu)、代謝途徑、調(diào)控機制以及人體各種生理和病理狀態(tài)的分子機制，是推動新的診斷、治療和預(yù)防方法。對于中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學生而言，學習醫(yī)學分子生物學，不僅是為未來的專業(yè)課的學習打下基礎(chǔ)，也為將來的工作和繼續(xù)深造學習提供知識儲備。學生在學習時靠死記硬背，缺乏對知識的思考，不能將分子生物學的知識和臨床學科的內(nèi)容進行橫向聯(lián)系，導(dǎo)致基礎(chǔ)理論知識和臨床實際應(yīng)用嚴重脫節(jié)。這無疑更不利于優(yōu)秀的中西醫(yī)結(jié)合人才的培養(yǎng)。因此，針對目前社會對高素質(zhì)中西醫(yī)結(jié)合人才的要求，必然需要我們針對中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)的特點，優(yōu)化分子生物學的教學內(nèi)容，探索有效的教學方法，以激發(fā)學生的學習興趣，強化學生對知識的記憶，培養(yǎng)學生將理論知識應(yīng)用到其他課程學習及今后臨床工作中的能力，真正發(fā)揮分子生物學在醫(yī)學研究領(lǐng)域的重要作用。
一分子生物學課程教學的總體設(shè)計
分子生物學作為醫(yī)學臨床和科學研究的基本工具，發(fā)展速度快、應(yīng)用廣泛。根據(jù)中西醫(yī)結(jié)合人才培養(yǎng)的目標與要求，以“理論適度，突出應(yīng)用”為原則，優(yōu)化教學內(nèi)容，對教材內(nèi)容進行更新、精簡和重組。同時對教學學時加以調(diào)整，做到重點主要講，拓展自學為主，并且改變教學模式，采用多種教學方法。
（一）教學內(nèi)容整合和優(yōu)化
分子生物學內(nèi)容改革主要是以基礎(chǔ)知識為主體，積極反映本學科發(fā)展的新動向、新進展，力求做到“少而精”，由淺入深，循序漸進，既注意層次分明，又注意知識的連貫性及實用性。擬對教學內(nèi)容包括以下幾點更新和優(yōu)化。目前我校采用的《分子生物學》教材是第八版《生物化學與分子生物學》，之前采用過新世界中醫(yī)藥院校創(chuàng)新教材《分子生物學》第一版。中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)分子生物學大綱要求授課內(nèi)容包括緒論、基因與基因組、DNA的生物合成、RNA的生物合成、蛋白質(zhì)的生物合成、基因表達與調(diào)控、基因工程與癌基因。在培養(yǎng)設(shè)計中，《分子生物學》一般在《生物化學》之后學習。為了增強知識的連貫性和整體性將原來基因與基因組這章的內(nèi)容與基因表達調(diào)控內(nèi)容進行整合，重點介紹基因的結(jié)構(gòu)，病毒、原核和真核生物基因組的特點。原癌基因和癌基因這章的內(nèi)容，適度減少，原因是為了適應(yīng)當前知識的更新，在此處只做基本概念的介紹，同時，提醒學生要緊跟科學發(fā)展，追蹤相關(guān)知識的更新。其他章節(jié)適度增加科學研究的新進展，而教學內(nèi)容基本不變。除此之外，需要對一些章節(jié)的知識進行更新。例如基因表達牽涉到遺傳學和表觀遺傳學的內(nèi)容，尤其是表觀遺傳學是近幾年生命科學研究的熱點，其對基因表達的調(diào)控涉及生殖發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)和疾病的產(chǎn)生。而目前《分子生物學》的“基因表達調(diào)控”一章只介紹了“原核生物的表達調(diào)控”和“真核生物表達的調(diào)控”兩節(jié)內(nèi)容，沒有表觀遺傳學的內(nèi)容，應(yīng)予以適當添加，考慮到學時的限制，我們擬在表觀遺傳學的基本概念、調(diào)控方式和研究策略上做簡單的概括性的介紹。另外，在目前的分子生物學研究中，常常牽涉到基因組學的研究，其內(nèi)容涉及海量的生物學信息的推導(dǎo)和計算。例如引物設(shè)計、測序比對、同源分析、表觀遺傳位點分析和組學研究分析等等。這就牽涉到一個重要的工具學科—生物信息學的學習。但是目前許多中醫(yī)類院校忽視對此內(nèi)容的學習。考慮到此學科的難度，我們擬簡單介紹生物信息學的基本內(nèi)容和常用的生物軟件的用途及使用方法，為他們在以后的工作和研究中打下基礎(chǔ)。再而，細胞通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是目前中醫(yī)藥科學研究重點強調(diào)的內(nèi)容，但目前本章的學習內(nèi)容主要在強調(diào)基礎(chǔ)知識，忽視了與科研和臨床實際問題相結(jié)合。因此在本章中，我們擬整合和提煉基礎(chǔ)知識，重點講授與常見生理病理（例如糖尿病、細胞凋亡等）密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
（二）課時的合理分配
分子生物學是從分子水平探索生命現(xiàn)象、生命活動的規(guī)律和本質(zhì)的一門學科。因此，學習的內(nèi)容牽涉到蛋白質(zhì)、核酸等分子。本科階段的教學目標是通過本課程的學習，使學生掌握分子生物學的基本理論、基本技能和最新進展，并特別注重與基礎(chǔ)醫(yī)學和臨床醫(yī)學的結(jié)合，從而為學生進一步學習其他專業(yè)課程和開展醫(yī)學研究工作奠定醫(yī)學分子生物學基礎(chǔ)。因而，在課時分配上注重對基本理論和基本技能的側(cè)重。安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)分子生物學的總學時是36學時，其中理論27學時，實驗時。理論學時中，緒論1學時，基因與基因組2學時，DNA的生物合成•4學時，RNA的生物合成4學時，蛋白質(zhì)的生物合成4學時，基因表達與調(diào)控4學時，基因工程6學時和癌基因2學時將原來的DNA生物合成的4學時變?yōu)?學時，原癌基因與抑癌基因由2學時變?yōu)?學時。原來的基因表達調(diào)控由4學時變?yōu)?學時（將基因與基因組的內(nèi)容整合到基因表達調(diào)控章節(jié)之前）。實驗學時的分配沒有變化，PCR技術(shù)應(yīng)用3學時，核酸的制備和測定6學時。
二教學方法的革新
在教學過程中我們要根據(jù)教學內(nèi)容采用一定的教學方法，這主要是由于不同的教學方法都有其適用性，而教學方法本身不存在絕對的優(yōu)劣。《分子生物學》各章內(nèi)容都有其關(guān)鍵知識點，而每一知識點都有其特點，任何單一的教學方法對每一關(guān)鍵知識點而言并不總是最適合的。學生有了實際的參考的物質(zhì)加以想象后就很容易理解這些抽象的知識要點，再進行理解記憶就變得相對簡單了。且有了這樣的類比經(jīng)驗可以啟發(fā)學生產(chǎn)生更多的想象，讓這個分子生物學的某些知識變得簡單易懂。歸納和總結(jié)一直是醫(yī)學基礎(chǔ)課學習的重要方法。分子生物學的許多概念、分子結(jié)構(gòu)特點和反應(yīng)過程比較相近，學生易于混淆。例如，重疊基因與重復(fù)序列、啟動子與增強子等。諸如這類概念或化學過程相近的知識點，關(guān)鍵是使學生掌握兩者的相同和不同點，因此對比歸納式教學方法就有其優(yōu)越性。教師通過對有聯(lián)系的知識點的對照歸納分析，有助于突出重點、易化難點，有助于將知識條理化、系統(tǒng)化，使學生把握住知識點內(nèi)在的聯(lián)系和區(qū)別，達到認識其本質(zhì)的目的。基于上述原因，對優(yōu)化后的各章關(guān)鍵知識點，采用不同教學方法如類比聯(lián)想、歸納比較、引導(dǎo)啟發(fā)和理論聯(lián)系實際等方法進行講授，比較各教學方法在此知識點的適用性和優(yōu)劣性，最終優(yōu)化出一套適合中西醫(yī)結(jié)合臨床專業(yè)多元教學方法體系。
三緊密聯(lián)系臨床實際應(yīng)用
分子生物學學習的目的是為臨床服務(wù)的，因此在教學上需要多聯(lián)系實際的醫(yī)學問題，即理論聯(lián)系實際的教學方法。例如，在講授DNA是遺傳信息載體的時候，可以將DNA指紋聯(lián)系到實際醫(yī)學的基因診斷和基因治療；在基因表達調(diào)控中，將遺傳學（單基因與多基因遺傳病）和表觀遺傳學調(diào)控，如DNA甲基化（組蛋白修飾）的表觀遺傳調(diào)控與心血管等疾病聯(lián)系在一起；在癌基因與抑癌基因內(nèi)容時，可以將臨床實際遇到的癌癥的遺傳特點和檢測方式中加以引入。通過這種和實際的醫(yī)學診斷和治療相結(jié)合的方法使學生認識到學習內(nèi)容可以直接解決實際的健康問題，將極大地調(diào)動學習熱情和興趣，提高學習效果。四建立科學合理的評價體系為了提高學生的質(zhì)量，使其更能適應(yīng)社會需求，安徽中醫(yī)藥大學積極進行教學改革，要求轉(zhuǎn)變教育思想，改變以前課堂教學的形式和對學生的評價體系。為此，在中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)分子生物學的評價體系中，初步建立形成性評價。評價體系主要包括考勤（10%）、課堂問題（20%）、每章科學問題討論（20%）和試卷成績（50%）課堂提問主要是每次課教師準備三個問題，讓學生回答，根據(jù)回答情況，進行評分。每章科學問題討論采用PBL形式，分組完成，最后給于評價。這種方式實施極大的調(diào)動學生的積極性，根本上改變之前僅依靠期末試卷帶來的學生惰性式學習習慣，培養(yǎng)了學生的學習興趣，課堂氣氛活躍，學生課下投入的時間大大提高，學習的自主性和能動性都得到大大增強。和一些形成性評價相似，課時、場地的限制和教師與學生比例失調(diào)限制了這種評價體系的實施。五結(jié)語分子生物學是生命科學的分支，是中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學生必須熟練的基本知識和基本技能。在分子生物學的教學過程中，要密切聯(lián)系臨床的實際應(yīng)用，及時聯(lián)系科學研究動態(tài)，才能激發(fā)學生的學習興趣，培養(yǎng)學習的積極性和調(diào)動學生自主學習的能力，使他們不僅能現(xiàn)在掌握分子生物學的基本知識，還能在未來工作中繼續(xù)跟蹤醫(yī)學分子生物學的發(fā)展，適應(yīng)社會對新型中西醫(yī)結(jié)合專門醫(yī)療人才的要求。
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表觀遺傳學的發(fā)展范文第5篇
【摘要】
目的RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活在卵巢癌中頻見，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學指標，RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白2A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）與RASSF1A同源，其基因異常甲基化在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究探討上皮性卵巢癌組織RASSF2A甲基化水平，并分析其臨床意義及高甲基化與mRNA表達情況的相關(guān)性。方法選擇2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫(yī)院手術(shù)治療的50例上皮性卵巢癌、27例交界性上皮性卵巢腫瘤和20例良性上皮性卵巢腫瘤患者，應(yīng)用甲基化特異性PCR（MSP）檢測卵巢腫瘤組織中RASSF2A基因啟動子甲基化狀態(tài)，采用RT－PCR檢測其mRNA表達水平。采用5－氮雜2′－脫氧胞苷（5－aza－dC）對人卵巢癌細胞株SKOV3、3AO進行去甲基化干預(yù)實驗，并檢測藥物作用前后RASSF2A基因啟動子甲基化及其mRNA的表達情況。結(jié)果RASSF2A基因mRNA在良性上皮性卵巢腫瘤中的表達陽性率為95．00％（19／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為59．26％（16／27），上皮性卵巢癌組織為34．00％（17／50），表達強度依次下降，差異有統(tǒng)計學意義，χ2＝21．855，P＜0．001。RASSF2A基因啟動子在良性上皮性卵巢腫瘤組織中的甲基化率為0（0／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為22．22％（6／27），上皮性卵巢癌組織為46．00％（23／50），差異有統(tǒng)計學意義，χ2＝15．474，P＜0．001。RASSF2A甲基化水平與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。RASSF2A基因甲基化與其mRNA的表達呈負相關(guān)，甲基化陽性組織的mRNA表達水平明顯低于甲基化陰性組織。5－aza－dC藥物作用后，卵巢癌細胞株中RASSF2A基因甲基化被逆轉(zhuǎn)，而其基因表達明顯升高。結(jié)論RASSF2A啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因表達沉默與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】
上皮性卵巢癌；甲基化；RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白2A基因；基因檢測
上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中惡性程度最高和預(yù)后最差的腫瘤，其病死率居婦科惡性腫瘤首位［1］。大量研究已證實，RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活是卵巢癌中的頻發(fā)事件，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學指標［2－4］。與RASSF1A具有高度同源性的RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）異常甲基化在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過RT－PCR和MSP方法檢測良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織及卵巢癌細胞株中RASSF2AmRNA的表達及其啟動子甲基化狀態(tài)，分析RASSF2A啟動子甲基化與其mRNA的表達以及卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系，探討RASSF2A啟動子區(qū)甲基化在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
1材料與方法
1．1標本來源收集2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的上皮性卵巢癌患者50例，交界性上皮性卵巢腫瘤27例，良性上皮性卵巢腫瘤20例。所有組織標本均經(jīng)病理學確診，所有患者術(shù)前均未接受任何放化療或激素治療。標本采集在離體后10min內(nèi)進行，并迅速放入液氮罐保存，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存。上皮性卵巢癌病例中，依據(jù)2006年FIGO分期標準，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期31例；依據(jù)2003年WHO組織學分類標準，漿液性腺癌24例，黏液性腺癌16例，子宮內(nèi)膜樣癌10例；高分化10例，中分化15例，低分化25例；有淋巴轉(zhuǎn)移27例，無淋巴轉(zhuǎn)移23例；年齡＜50歲者19例，≥50歲者31例。
1．2細胞株卵巢癌細胞株SKOV3和3AO由聊城市人民醫(yī)院中心實驗室提供。
1．3主要試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，DNA甲基化試劑盒購自德國Qiagen公司，引物均由上海生工設(shè)計合成。
1．4實驗方法
1．4．1細胞培養(yǎng)及藥物處理在37℃、5％CO2及飽和濕度的孵育箱中靜置培養(yǎng)卵巢癌細胞株，用含10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基及時換液。用終濃度為10μmol／L的5－aza－dC處理卵巢癌細胞株，常規(guī)換液，保持上述藥物濃度。于藥物連續(xù)作用72h后收集細胞。
1．4．2RT－PCR檢測參照Trizol試劑說明書提取組織及細胞總RNA。測得其濃度及純度符合實驗要求后，取2μL總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA經(jīng)半定量PCR擴增。RASSF2A基因上游序列為5′－GCG－CCTAGAACGTGTTTTTC－3′，下游序列為5′－ACT－AGGCGTCCTCACATTGC－3′，擴增產(chǎn)物長度為563bp。以GAPDH作為內(nèi)參基因，上游為5′－CAA－CGGATTTGGTCGTATT－3′，下游為5′－CACAGTC－TTCTGGGTGGC－3′，擴增片段長度為166bp。PCR反應(yīng)條件為95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察實驗結(jié)果。
1．4．3DNA的提取及亞硫酸鹽修飾采用酚氯仿法提取組織及細胞總DNA，并對基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾，按照甲基化特異性PCR試劑盒說明書進行。所得產(chǎn)物直接用于PCR擴增或保持在－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1．4．4甲基化特異性PCR使用2對引物檢測RASSF2A基因啟動子甲基化狀態(tài)。甲基化引物正義鏈為5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′，反義鏈為5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′，非甲基化引物正義鏈為5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTA－GGTGG－3′，反義鏈為5′－AAAAAACCAACAACCC－CCACA－3′，擴增產(chǎn)物長度均為108bp。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，58℃復(fù)性30s（甲基化）；54℃復(fù)性30s（非甲基化），72℃延伸30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。所得產(chǎn)物電泳后攝像，分析結(jié)果。
1．4．5甲基化結(jié)果判定標準若僅甲基化引物擴增出陽性條帶，為完全甲基化；若僅非甲基化引物擴增出陽性條帶，為非甲基化；若兩者均擴增出陽性條帶，為部分甲基化。
1．5統(tǒng)計學方法采用SPSS13．0分析數(shù)據(jù)。RASSF2A甲基化、mRNA表達在卵巢腫瘤組織間的差異以及基因甲基化與臨床病理特征等計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fishier確切概率法。RASSF2A甲基化及其表達之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析法。卵巢癌細胞系中RASSF2AmRNA表達量比較采用t檢驗。檢驗水準α＝0．05。
2結(jié)果
2．1卵巢腫瘤組織RASSF2AmRNA的表達表1和圖1所示，卵巢良性腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中RASSF2AmRNA表達率依次降低，分別為95．00％（19／20）、59．26％（16／27）和34．00％（17／50），差異有統(tǒng)計學意義，χ2＝21．855，P＜0．001。兩兩比較結(jié)果顯示，卵巢癌組與交界性腫瘤組比較，χ2＝4．568，P＝0．033；卵巢癌組與良性腫瘤組比較，χ2＝21．280，P＜0．001；交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較，χ2＝7．719，P＝0．005；差異均有統(tǒng)計學意義。
2．2卵巢腫瘤組織RASSF2A基因甲基化水平表1和圖2所示，97例卵巢組織標本均成功進行了MSP實驗。50例卵巢癌組織標本中有13例發(fā)生了部分甲基化，10例完全甲基化，甲基化頻率為46．00％（23／50）；27例交界性卵巢腫瘤中甲基化陽性率為22．22％（6／27），其中2例為完全甲基化。而20例良性卵巢腫瘤組織均未擴增出甲基化陽性條帶，甲基化頻率為0，差異有統(tǒng)計學意義，χ2＝15．474，P＜0．001。
2．3RASSF2A基因甲基化與其表達的相關(guān)性表2所示，RASSF2A基因甲基化狀態(tài)與其mR－NA表達水平呈負相關(guān)。在RASSF2A基因發(fā)生甲基化的組織中，RASSF2A基因表達明顯降低，提示RASSF2A基因高甲基化可能是該基因表達沉默的原因之一。
2．4甲基化狀態(tài)與卵巢癌臨床病理特征相關(guān)性表3所示，RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯的相關(guān)性。
2．55－aza－dC作用結(jié)果圖3所示，卵巢癌細胞株SKOV3和3AO中均檢測到RASSF2A基因甲基化，經(jīng)去甲基化藥物5－aza－dC作用后，SKOV3細胞由完全甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆?AO細胞甲基化狀態(tài)被部分逆轉(zhuǎn)。SKOV3和3AO中RASSF2AmRNA表達水平較低，經(jīng)藥物干預(yù)后，SKOV3（t＝－5．258，P＝0．006）和3AO細胞株（t＝－3．060，P＝0．038）RASSF2AmRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。
3討論
近年來，隨著腫瘤分子生物學及表觀遺傳學的發(fā)展，腫瘤抑制基因失活在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們的重視。總的來說，其機制可概括為遺傳學機制及表觀遺傳學機制，換言之，腫瘤抑制基因功能的失活既可以是不可逆的，即遺傳學機制，如基因的突變或染色體的缺失，也可以是可逆的，即表觀遺傳學機制，如基因甲基化或組蛋白修飾。與遺傳學不同，表觀遺傳學主要研究內(nèi)容不涉及DNA序列的改變，且在細胞分裂過程中具有可遺傳的、可逆性的基因組修飾作用［5］。DNA甲基化是哺乳動物基因組中最普遍的表觀遺傳學事件。相對于Knudson’s的二次打擊學說，基因甲基化僅靠一次打擊就可導(dǎo)致基因失活，腫瘤易感性增加［6］。RASSF2是新近發(fā)現(xiàn)的RASSF家族成員之一，生物信息學分析顯示，RASSF2與其他成員一樣，也含有RAS相關(guān)域［7］。RASSF2位于人類常染色體20p13，有329個氨基酸的開放閱讀框，11個外顯子。根據(jù)不同的啟動子和外顯子選擇剪接，可形成RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C3個不同的轉(zhuǎn)錄本，其中，RASSF2A是最長的轉(zhuǎn)錄本，也是唯一一個含有5′CpG島的轉(zhuǎn)錄本。RASSF2A在卵巢癌組織中發(fā)揮抑癌基因的作用，如抑制細胞生長，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡等，是一個腫瘤抑制基因。本研究分析了RASSF2A基因在上皮性卵巢癌組織中的轉(zhuǎn)錄表達及其甲基化水平。RT－PC檢測結(jié)果顯示，RASSF2A基因表達水平在良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中依次降低，提示RASSF2A的轉(zhuǎn)錄失活，可能參與了卵巢癌的惡性演進過程，RASSF2A在上皮性卵巢癌中也起到抑癌基因的作用。張嫻等［8］研究結(jié)果顯示，RASSF2A基因甲基化可能參與了宮頸癌的發(fā)生，與宮頸癌的惡性進展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，良性卵巢腫瘤組織中未發(fā)生RASSF2A啟動子區(qū)甲基化，而基因異常甲基化從交界性腫瘤到癌呈逐漸上升的趨勢，RASSF2A基因甲基化從無到有，從少到多的現(xiàn)象，說明了RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化從卵巢上皮增殖階段就開始起作用，與卵巢癌發(fā)生密切相關(guān)。多項研究表明，RASSF2A啟動子區(qū)高甲基化與基因表達沉默有關(guān)［9－11］。本研究結(jié)果表明，在發(fā)生RASSF2A甲基化的組織中，其基因表達水平明顯下降，兩者呈負相關(guān)。結(jié)果提示，在卵巢癌中RASSF2A啟動子甲基化是導(dǎo)致其低表達或者表達缺失的重要原因，這在細胞試驗中也得到驗證。應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5－aza－dC對卵巢癌細胞株進行去甲基化處理后，卵巢癌細胞株的基因啟動子甲基化被逆轉(zhuǎn)，而其mR－NA的表達水平明顯升高，從而進一步證實了RASSF2A啟動子CpG島的異常甲基化在調(diào)節(jié)RASSF2A基因的表達中發(fā)揮重要作用。研究顯示，RASSF2A基因甲基化程度與宮頸癌、胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［8，12］，而與胰腺癌和結(jié)直腸癌［9，13］患者臨床病理特征無關(guān)。另有研究表明，基因啟動子甲基化水平與癌癥患者年齡密切相關(guān)［14］。在子宮內(nèi)膜癌的研究中顯示，＞45歲的患者更容易發(fā)生RASSF2A甲基化（P＝0．041）［15］。在結(jié)腸癌和口腔鱗癌中也發(fā)現(xiàn)，RASSF2A基因甲基化程度與年齡相關(guān)［13，16］。在生物個體發(fā)育過程中，伴隨著時間的進程，DNA甲基化異常會不斷呈現(xiàn)，由此認為，表觀遺傳學疾病是一種與年齡相關(guān)性疾病。這在某種程度上解釋了為什么腫瘤多發(fā)生在老年人。檢測DNA甲基化程度可作為細胞衰老的標志之一。本研究結(jié)果顯示，RASSF2A基因甲基化水平與卵巢癌患者的臨床病理參數(shù)之間無明顯的相關(guān)性，是上皮性卵巢癌中的早期頻發(fā)事件，隨著患者年齡的增加，RASSF2A基因甲基化有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，可能上皮性卵巢癌中RASSF2A基因甲基化不是年齡相關(guān)的表觀遺傳學改變。
綜上所述，RASSF2A啟動子區(qū)的高甲基化是卵巢癌發(fā)生和發(fā)展過程中的頻發(fā)事件，是導(dǎo)致卵巢癌中RASSF2A低表達或表達缺失的重要原因，其參與了卵巢癌的發(fā)病過程，并在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。監(jiān)測RASSF2A基因啟動子CpG島甲基化水平可作為表觀遺傳學的分子靶標，指導(dǎo)卵巢癌的診斷及其預(yù)后判定。
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