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本文作者：吳錫1,2許麗英1張雪霞1宋雨1,2王新1賈永鋒1作者單位：1.中國科學院沈陽應用生態研究所污染生態與環境工程重點實驗室2.中國科學院研究生院

砷污染是一個全球性的環境問題［1～3］，由于自然因素和人為因素的影響，土壤、地下水和地表水等環境的砷污染嚴重危害人類的健康和生態環境［2～4］．據調查，我國重金屬污染的耕地面積達2000萬hm2，約占我國耕地總面積的1/5，許多城市和工礦區的土壤都受到不同程度的砷污染［5］，對我國的食品安全、環境質量和人們的健康構成嚴重威脅［6～11］．砷的毒性與生物有效性在很大程度上由砷的賦存形態決定，而砷的形態轉化直接關系到砷的環境行為及其環境效應．通常土壤中的砷主要包括As(Ⅴ)和As(Ⅲ)這2種形態，二者可因環境條件改變或在環境微生物作用下相互轉化［12，13］．土壤微生物對砷的還原作用可以直接或間接地影響其賦存形態與環境行為．在土壤中砷大部分與鐵、錳、鋁氧化物礦物、黏土礦物及腐殖質等結合，不同形態的砷與礦物的親和力有所區別，當五價砷被還原為三價砷后，土壤礦物對其吸持能力明顯降低，可引起砷的活化和釋放［14～16］．另一方面礦物中鐵的氧化物或氫氧化物礦物是固定砷最重要的基質，微生物對鐵的形態轉化同樣是影響砷的形態與環境行為的關鍵因素．國內外已有大量研究證實微生物對砷和鐵的還原作用強烈地影響土壤中砷的賦存形態與環境行為．例如，Vaxevanidou［17］和Wang［18］等發現土壤中砷的環境行為是由微生物對鐵和砷的還原作用共同調控，微生物引起的鐵的還原性溶解驅動了砷的釋放行為．在微生物對砷的活化與釋放過程中，硫酸鹽還原過程是調控砷的另一重要因素，硫酸鹽還原產物H2S可直接或間接地影響砷的環境行為及穩定性．一方面，在溶解態硫離子與土壤溶液中亞鐵離子沉淀的過程中，游離的砷可以被硫化亞鐵吸附或共沉淀;另一方面，水相中的H2S也可以與釋放的亞砷酸鹽反應沉淀為硫化砷．因此當微生物作用下土壤中的砷、鐵、硫同時被還原時，砷的形態轉化與環境行為將受到多種物理化學和生物因素的控制，其環境行為機制也更加復雜．盡管國內外學者針對上述砷的地球化學循環的一般性機制和一些砷污染土壤開展了大量研究，并取得了很多重要成果［14～21］，但對于土壤中多元素共同調控下砷的環境行為及其形態轉化的微生物學與化學機制仍需要進一步研究．本研究利用清潔土壤負載低劑量砷來模擬砷污染土壤，開展缺氧條件下土壤微生物作用對砷的形態轉化與環境行為的影響，并探討砷釋放與固定的機制，旨在為評價砷土壤的環境風險及建立污染修復方法提供依據．

1材料與方法

1.1土壤砷的負載

土壤樣品采自沈陽張士污灌區，0～100cm深，樣品每20cm為一層，分層裝入自封袋，當天帶回實驗室－4℃冰箱冷凍．土壤消解后測定其中主要元素，如表1所示．其中砷的本底值為10mg•kg－1．采用1∶5的固液比進行砷的負載(6.6mg•L－1的Na3AsO4溶液砷酸鈉溶液)，35℃，170r•min－1，避光，平衡24h．4000r•min－1離心10min，傾出上清，并用蒸餾水振蕩離心洗滌2次固體，測液相砷的殘留濃度，保留固體．負載后，土壤體系砷含量為40mg•kg－1.

1.2細菌的富集培養

基礎鹽培養基(MSM，g•L－1):KH2PO40.14，NH4Cl0.25，KCl0.5，CaCl2•2H2O0.13，NaCl1.0，MgCl2•6H2O0.62，酵母提取物0.5，乳酸鈉2mL•L－1，外加硫源無水Na2SO410mmol•L－1，用1mol•L－1NaOH調節pH為7.0～7.2．向載砷土壤中加入培養基，以1∶20的固液比，在35℃下170r•min－1恒溫振蕩器中避光培養8d．培養基采用無氧水配制，配制過程氮氣保護，將培養基在厭氧手套箱中加入載砷土壤，于厭氧瓶中培養，以保證厭氧條件．用高壓滅菌鍋將土壤滅菌，作為對照組．非生物對照組實驗的固液比、溫度等所有培養條件與生物培養組相同．

1.3分析方法

為避免樣品氧化，取樣與樣品處理在厭氧手套箱中進行．樣品搖勻后取5mL培養液用0.45μm的濾膜過濾，濾液用于分析溶解態的Fe(Ⅱ)、Fe(T)(總鐵)、As(Ⅲ)和As(T)(總砷)的濃度．濾后固體用1mol•L－1HCl170r•min－1振蕩提取2h，4000r•min－1離心10min，上清液用于分析HCl提取態的Fe(Ⅱ)、Fe(T)(總鐵)、As(Ⅲ)和As(T)(總砷)的含量．另取土壤培養液5mL，加入5mL6mol•L－1HCl，170r•min－1提取5d，分析不同層土壤酸揮發態的S(即AVS)［23］．其中Fe(Ⅱ)和AVS立即進行厭氧顯色并測定，而用于測定As(Ⅲ)的樣品用0.4mol•L－1的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.5)1∶1稀釋后在冰箱中保存48h內測定．砷的形態測定［22］:As(Ⅲ)和As(T)濃度測定采用原子熒光光譜儀(AFS-2202，北京海光公司)進行．其中As(Ⅲ)樣品先用0.4mol•L－1的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.5)作為樣品稀釋液和載液;As(T)的樣品中加入10%體積的預還原劑(含5%硫脲和5%抗壞血酸的混合溶液)，用5%HCl定容，反應數小時后用原子熒光光譜儀測定As(T)．As(T)與As(Ⅲ)的差值即為體系中As(Ⅴ)的濃度．總鐵Fe(T)采用原子吸收光譜法分析［22］，亞鐵離子采用鄰菲啰啉分光光度法［22］，S2－離子采用亞甲基藍比色法測定［23］．

2結果與討論

2.1微生物作用下砷的釋放

在微生物作用下無外加硫的培養體系中各層土壤均見明顯的砷還原與釋放，但不同深度土壤砷的釋放程度有所不同，如圖1．20～40cm深度土壤砷的釋放量明顯高于其它層土壤，As(Ⅲ)和As(T)分別達到892.8μg•L－1和1240.6μg•L－1，與對照組相比，分別增加了856.7μg•L－1和995.2μg•L－1，在不同深度土壤的培養體系，液相中超過70%的砷是以As(Ⅲ)形式存在，非生物對照中幾乎沒有亞砷酸鹽．可見是微生物的作用造成土壤中砷的釋放．在外加硫體系中，溶解態的As(Ⅲ)和As(T)較無外加硫體系均明顯降低，其中20～40cm深度土壤As(Ⅲ)和As(T)分別降低了499.6μg•L－1和676.2μg•L－1，降低幅度最大，而在60cm以下深度土壤的培養組中，砷的釋放量變化都不大，As(Ⅲ)和As(T)釋放大約減少300μg•L－1和160μg•L－1，說明土壤中微生物的數量和活性強烈的影響體系中硫酸鹽的還原過程以及砷的環境行為．與深層土相比，表層土中的微生物在數量和活性都占有優勢，表土中補加硫酸鹽后明顯抑制了砷的釋放行為．體系中補充適量的硫酸鹽可以大大抑制了砷的釋放行為，在硫酸鹽微生物作用下體系中硫酸鹽還原產物-硫離子可通過產生鐵的硫化物以吸附或共沉淀方式重新固定被釋放的砷，或者直接產生砷的硫化物沉淀，使被釋放的砷再次被固化，回到固相中．從圖1可以看出非生物對照組中也有部分溶解態砷釋放，但大多以As(Ⅴ)形式存在，幾乎沒有As(Ⅲ)釋放，只有無硫培養體系中少量的As(Ⅲ)，可能是原有土壤中存在的少量As(Ⅲ)被釋放出來．這可能由于培養基中的乳酸鹽對砷具有一定的解吸附作用，—COOH與As(Ⅴ)競爭吸附后位點，造成砷有一定量的釋放［24］．盡管培養液本身也可引起固相少量的砷溶解，但土壤微生物作用是造成砷的還原與釋放的根本因素.

2.2微生物作用下鹽酸可提取態砷的形態分析

砷在土壤中的結合形態決定砷的環境效應和生物有效性．鹽酸可提取的砷形態主要指鹽酸可以溶解的無定形鐵錳氧化物、部分結晶度很差的結晶態鐵氧化物結合的砷以及酸揮發硫吸附或共沉淀的砷［25］．圖2給出了在微生物作用下不同土層固相中鹽酸可提取態As的形態與含量情況．從圖2中可以看出，與對照培養組相比無論培養體系中是否外加硫酸鹽，每層土中鹽酸可提取的砷總量都大大降低，而且固相中鹽酸提取的As(T)幾乎全部轉化為As(Ⅲ)．其中在沒有外加硫源的體系中，0～20cm表土的培養組中固相中鹽酸提取態的砷中As(Ⅲ)升高了約2.2mg•kg－1，但鹽酸可提取的As(T)大大減少，As(T)約減少了9.9mg•kg－1．隨著深度增加，鹽酸提取態As(Ⅲ)和As(T)略有增加．與未加硫的培養體系相比，在外加硫酸鹽的培養體系中經過微生物還原后無論是表層土壤還是深層土壤中鹽酸可提取的總砷量均進一步降低，其中表土0～20cm鹽酸可提取態As(T)約為1.5mg•kg－1，與不加硫的體系相比約降低了50%，約占非生物對照組鹽酸可提取砷總量的11.4%，而加硫與未加硫的非生物對照組相比變化不大．由表2中數據可以看出，與未加硫的體系相比加硫體系中液相被釋放的砷和固相中鹽酸可提取的As(T)的量都大大降低，液相中砷和固相鹽酸提取的砷總量減少了16.5%，相當于不加硫生物培養組中釋放的砷和鹽酸可提取砷總量的37.1%轉化為鹽酸不可提取的形態，可見在不加硫條件下，微生物還原作用造成了砷被還原、活化和釋放，而外源硫的加入促使微生物還原/活化的砷轉化成更加穩定的形態．在前期研究中發現微生物的還原作用可以將砷轉化為穩定的礦物形式固定下來，如砷還原菌Desulfotomaculumauripigmentum能夠將體系中的As(Ⅴ)和硫酸鹽同時還原形成As2S3沉淀，因此增加砷的穩定性［26］．而Kirk等［27］的研究也發現硫酸鹽還原菌可通過生成硫化物固持砷．同時在長期的培養過程中新生的和老化的硫化亞鐵或者次生的黃鐵礦等都是具有較強的固砷能力［28，29］．因此，砷的形態可伴隨著體系中其它元素的形態轉化而轉化，在本研究中也發現硫酸鹽還原過程促進砷轉化為更穩定的鹽酸不可提取態，可能與新生的礦物黃鐵礦相結合，或者被轉化為砷的硫化物．

2.3微生物作用下鐵的形態轉化

在本研究中，微生物的還原作用不僅引起砷的形態轉化，同時微生物作用下鐵的還原和釋放，以及相伴隨的硫酸鹽還原過程強烈的影響著砷的環境行為．圖3給出了微生物作用下鐵的形態轉化，并采用鹽酸提取土壤中的無定形鐵氧化物和弱結晶度的結晶態鐵氧化物以及酸揮發性硫化物中的鐵，研究固相中鐵的形態轉化與砷的環境行為的關聯．由圖3可知，未加外源硫的培養體系中，各層土壤鐵的釋放量有所不同，大部分釋放的鐵都以還原態的Fe(Ⅱ)形式存在，而非生物對照組中幾乎沒有溶解態Fe(Ⅱ)存在，可見體系中微生物還原作用引起了土壤礦物中鐵的還原性溶解．在微生物作用下固相中鹽酸可提取的總鐵量大大增加，其中在表層0～20cm土壤鹽酸提取態的Fe(Ⅱ)和Fe(T)分別增加了約4956.0mg•kg－1和2248.0mg•kg－1，還原態的亞鐵離子約占鹽酸可提取態總鐵的50%．而且與非生物對照組相比較各層土壤中鹽酸提取態總鐵的量大約都增加了30%，說明微生物的作用造成土壤固相中的鐵的活化．當外加硫酸鹽后，體系中溶解態的亞鐵離子大大降低．與不添加硫酸鹽的培養組相比，表層0～20cm土壤的培養組溶解態的Fe(Ⅱ)從40.0mg•L－1降低到0.4mg•L－1，深層60～80cm土培養組中溶解態Fe(Ⅱ)從50.1mg•L－1降低到1.1mg•L－1．可見添加硫酸鹽后液相中亞鐵離子的釋放過程大大降低，微生物作用下的還原產生的Fe(Ⅱ)與硫酸鹽的還原產生的硫離子結合沉淀進入固相．在微生物作用下培養8d后無論哪一層土中鹽酸可提取的總鐵量進一步大大增加，是非生物對照組鹽酸可提取鐵量的2～3倍．同時，添加與未添加硫酸鹽的培養組相比，表層0～20cm土中鹽酸可提取的總鐵含量增加最多，從9036.0mg•kg－1增加到15996.7mg•kg－1．這部分亞鐵的增長主要是來自于液相中被硫離子沉淀下來的Fe(Ⅱ)，說明通過添加硫酸鹽可以促進體系中被釋放的鐵的再固定過程，減少固相的鐵流失．固相中鹽酸提取的亞鐵離子中可能包括土壤中原有的極少量亞鐵礦物中的亞鐵，微生物直接催化鐵還原產生的亞鐵離子與體系中硫酸鹽的還原產物硫化氫發生沉淀而固定下來的亞鐵，以及硫化氫所參與固相中鐵的還原產生的亞鐵［30］．本研究中培養8d后的體系中，無硫體系中硫離子(濃度約為335.3μg•L－1)與亞鐵離子的離子積KIAP(約為7.6×10－9)遠遠大于硫化亞鐵的容度積Ksp(約為1.59×10－19)．因此可以確定體系中產生了硫化亞鐵，砷可以被新生的硫化亞鐵以吸附、包裹、沉淀或共沉淀等途徑固持．不過從鹽酸可提取的總鐵數據中可以看出，亞鐵所占的比例大約在50%左右，體系中還有較多高鐵礦物，體系中還原產生的亞鐵離子可以再次被吸附到鐵氧化物表面，因此體系中應存在部分的Fe3O4，新生的Fe3O4也可以結合部分的砷．一些學者研究認為［28，29］，新生的硫化亞鐵礦物在培養過程中會逐漸老化生成黃鐵礦(FeS2)，作為鹽酸不可提取的形態之一，黃鐵礦所固定的砷的形態更加穩定．不過硫化亞鐵向黃鐵礦轉化過程比較慢，在本研究培養的8d內即使形成了黃鐵礦，它的比例也非常低，因此在鹽酸不能提取的砷中，黃鐵礦結合的砷不會是主要形態，這部分砷的賦存形態很可能是主要以硫化物的形式存在．

2.4微生物作用下硫酸鹽還原與砷、鐵的環境行為的關聯

在天然混合微生物群的作用下，除了發生砷酸鹽還原過程外，通常也伴隨著鐵和硫的還原過程．硫酸鹽還原作用下產生的硫化氫可與體系中產生的亞鐵離子或亞砷酸鹽離子相結合，產生鐵的硫化物或砷的硫化物．形成硫化亞鐵沉淀時可以同時沉淀或共沉淀體系中釋放的砷酸鹽和亞砷酸鹽．這一過程在地下水或河流沉積物中多有發生，因此硫化亞鐵等酸揮發硫化物對固持重金屬離子具有很重要的作用［31，32］．本研究采用鹽酸提取酸揮發性的硫化物，研究硫化物與砷的環境行為的關聯．圖4給出了在缺氧培養的8d內體系中硫酸鹽的還原與硫化物的產量變化情況．從圖4可以看出，不同土層酸揮發硫的產量有所不同．可能由于表層土壤中有機質含量較高，因此無論是否外加硫酸鹽表土0～20cm土的培養組中AVS產量總是比其他土壤層的產量高很多．在未加硫酸鹽的培養體系中，酸揮發硫的產量都在2.5mg•kg－1以下，在外加10mmol•L－1的硫酸鹽后每層土壤的培養物中鹽酸AVS的量都超過200mg•kg－1．對于其他幾層的土壤而言，外加的硫酸鹽也大大促進了體系中硫化物的產量．圖4與圖2和圖3比較可以看出，鹽酸提取態的Fe(Ⅱ)與各土層AVS變化趨勢成正相關，硫化亞鐵是固相中鹽酸可提取的亞鐵離子的主要以形態．而在酸揮發硫或者說硫化亞鐵含量較高的培養組中鹽酸可提取的砷的量較低，二者呈負相關．體系產生的酸揮發硫越多，砷的釋放越少．可見土壤中原有的硫酸鹽含量不足，當外源提供足夠的硫酸鹽條件下微生物的作用硫酸鹽還原更見明顯，可以在很大程度上促進砷的固定．特別是微生物豐富的表層土中，加硫培養促進了體系中釋放的和鹽酸提取態的砷大大降低，以降低的總量計算相當于無硫體系中釋放的和鹽酸可提取的砷總和的37.1%的砷再次被轉化為鹽酸不能提取的穩定的形態．體系中硫離子和亞砷酸鹽在液相中的濃度及其離子濃度積，可作為判斷產生硫化物的依據．例如在表土0～20cm的不加硫的生物培養體系中，培養8d后體系中硫離子與三價砷的平衡濃度分別為335.3μg•L－1和562.2μg•L－1，而加硫的體系中硫離子與三價砷的平衡濃度69.85mg•L－1和318.9μg•L－1，根據液相中S－2及As(Ⅲ)的平衡濃度進行估算，不加硫系統的lgKIAP約為－25.2，加硫體系中lgKIAP-S約為－18.7，無論那個體系培養8d后三價砷及硫離子的離子積的lgKIAP都大于lgKSP(約為－46.22［33］，其中KIAP表示液相中三價砷與硫離子的離子積，KSP表示As2S3的容度積)，說明無論是否補加硫酸鹽，體系中產生了As2S3沉淀．不過由于土壤中礦物成分太復雜，新生礦物的含量相對較低，目前還沒有更直接的光波譜數據加以證實，這部分仍有進行待進一步的表征和研究．

3結論

(1)在張士污灌區的土壤中，土著微生物具有較強的砷、鐵和硫的還原能力．(2)微生物對鐵和硫的還原作用及其還原產物共同調控砷的環境行為，在不加硫條件下，微生物對鐵氧化物的還原性溶解造成了砷的活化和釋放，補加硫酸鹽可以抑制砷的釋放過程，使已活化的砷再次被固持．(3)在硫酸鹽還原作用下形成非常穩定的硫化物礦物As2S3是土壤微生物固定砷的主要途徑．