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1光密度定量的意義

醫學形態學研究隨著科技的飛速發展,常用研究方法從細胞水平(光鏡組織切片、細胞培養、電鏡透射掃描、免疫電鏡、流式細胞技術)發展到蛋白水平(免疫組化、WesternBlotting)和基因水平(原位分子雜交、PCR及測序等)。免疫組化染色方法自1986年由兩名中國人發現S-P法以后,以其便于交流,有配套的即用型抗體試劑盒和顯色試劑盒直接滴加,染色時間短,靈敏性高,特異性強等明顯優點,被實驗醫學研究者廣泛采用。對于用免疫組化或原位雜交法染色的組織切片、細胞涂片,測定其特異性染色陽性區的光密度值、積分光密度值,相對定量的表示某種特定蛋白的含量,受體配體、抗原抗體的結合程度或酶顯色的情況。傳統判定染色結果的方法是在顯微鏡下觀察陽性細胞數,小于25%為弱陽性(+),25-50%為陽性(++),50-75%為強陽性(+++),大于75%為特強陽性(++++)。現今應用圖像分析系統測量染色陽性區的光密度參數(光密度、積分光密度),用數值定量的表示染色程度,有利于進行統計學數據分析,使結論更客觀更準確。

2•1光密度(OpticalDensity)

根據Beer-Lamb吸收定理:一束單色平行光透過某種分布均勻的物質,光能被吸收,光能吸收量等于物質的克分子量;物質對光吸收的多少與照射光強度無關。光密度OD=Lg(1/T),平均透射率T=Greyi/Greyo×100%,Greyi為被測對像的平均灰度值(出射光強度,即透射光強度),Greyo為空白區域的平均灰度值(入射光強度,即本底光或光源的強度)。設定圖像分析系統光密度值和灰度值之間的轉換關系稱光密度定標。例如八比特(Bit)圖像為256級灰度:空白本底的OD空=LgGreyo/Greyi=Lg200/200=Lg1=0,全黑圖像的OD黑=LgGreyo/Greyi=Lg255/0→∞,理論上光密度值是(0<OD<∞)大于零小于無窮大的。實際上,假設出射光強度比入射光強度低100倍OD=Lg255/2.55=Lg100=2,出射光強度比入射光強度低10倍OD=Lg255/25.5=lg10=1,所以多數情況下光密度值為0<OD<1的數。定標時設空白本底的光密度值OD=0,全黑圖像的光密度值OD=2,計算機自動得出OD-Grey曲線,并按此關系進行灰度值和光密度值的轉換,計算出光密度值。從另一個角度看,平均透射率反映物體的透光性,亮意味著透光多,暗意味著透光少,光被吸收的多。T=10-kcd式中k為克分子吸收系數,c為物質的濃度,d為物質的厚度(光程),光密度值OD=lg1/T=10kcd=kcd,可見光密度OD與物質的濃度C成正比,光密度值的大小代表染色的深淺,反映物質的相對濃度。

2.2積分光密度(IntegratedOpticalDensity)

積分光密IOD=(GV.LgMaxGVGV)為構成被測對像的所有像素點的光密度的和。從另一個角度看,物質的濃度C=M/V(質量/體積)=M/Area×d光密度OD=kcd=K×M/(Area×d)×d=KM/AreaBeer-Lamb吸收定律要求物質分布是均勻的,但實際生物樣品中的被測對像分布大都是不均勻的,圖像分析軟件測量時將若干個像素定義成一個像元,像元很小,設面積為a,每個像元內物質分布被認為是均勻的。所以可認為物體整合光密度IOD=a×(OD1+OD2+OD3…ODn)=a×n×OD=Area×OD=Area×KM/Area=KM。由此可知,積分光密度與物質的質量M成正比,積分光密度值的大小代表被染色物質的多少,反映物質的相對含量。光密度定量為相對定量,需要對照組,測量時的系統誤差對實驗組和對照組而言是同樣的,不會對結果有影響。需要注意的是應選擇無疵點、無污漬的薄厚均勻的載玻片和蓋玻片,使用相同的封片劑。嚴格控制切片的厚度和染色條件的一致,測量光密度的樣品最好不要復染,盡量減少樣品染色的不一致或不均勻。定購染色試劑時最好同時購買陽性對照片,以便做圖像分析時用它準確設定陽性閾值(Thresh-oldRang)。圖像獲取時光的條件要求嚴格一致,盡量用40倍的物鏡采集圖像,以便測量時精確分割圖像。